南方水稻黑條矮縮病的監(jiān)測及其病原病毒Pns6與寄主水稻的互作.pdf

1、水稻（Oryza sativa）是我國的主要糧食作物，病毒病一直是影響我國糧食穩(wěn)定生產(chǎn)的一個重要問題。近十年來，多種水稻病毒病相繼爆發(fā)流行，給水稻生產(chǎn)造成了巨大的經(jīng)濟損失，其中由一種新的植物呼腸孤病毒---南方水稻黑條矮縮病毒（Southern Rice black streaked dwarf virus，SRBSDV）引起的南方水稻黑條矮縮病尤為重要。國內(nèi)外學者對這種新病毒的生物學和分子生物學進行了許多研究，明確了南方水稻黑條矮縮病

2、的地理分布、癥狀、病原性質(zhì)、傳播途徑、品種抗性等生物學特性，并解析了病毒的基因組結構和少數(shù)編碼蛋白的功能，但是對于病毒在寄主組織的分布和動態(tài)變化、多數(shù)編碼蛋白的功能、病毒的致病機制、寄主抗感病作用機制等仍不清楚。因此，保持對水稻病毒病的監(jiān)測，了解病毒在寄主體內(nèi)的分布和動態(tài)變化，以及研究病毒與寄主間的互作關系，對于病毒病的防控以及闡明病毒的致病機制等方面具有重要的意義。
　　首先，于2009-2012年間，在湖北、福建、江西、湖南、

3、海南等省進行了水稻病毒病田間流行調(diào)查，并承擔了這些省份水稻病毒病的診斷和檢測任務，在此基礎上，分析了水稻病毒病的種類、分布和流行特點。結果如下：首次報道了南方水稻黑條矮縮病毒在湖北水稻和玉米上的發(fā)生，以及驗證了水稻條紋病毒在湖北水稻產(chǎn)區(qū)的存在；福建水稻病毒的種類較多，有SRBSDV、RBSDV(Rice black streaked dwarf virus)、RSV(Rice stripe virus)、RRSV(Rice ragged

4、 stunt virus)、RDV(Rice dwarf virus)、RGSV(Rice grassy stunt virus)，國內(nèi)流行的水稻病毒病在福建均有分布；湖南和江西兩省是近幾年我國水稻病毒病發(fā)生的重災區(qū)，病原以SRBSDV為主，RRSV次之；海南省是我國南方水稻黑條矮縮病和水稻鋸齒葉矮縮病的重要初侵染來源地。
　　其次，測定了 SRBSDV湖北分離物的全基因組序列，并以此序列為基礎擴增了病毒13個基因的全長，在本氏煙

5、細胞中分別表達這些基因，觀察所表達蛋白的亞細胞定位。結果顯示：SRBSDV湖北分離物全長29122 bp，基因組核酸S10-S1的登錄號分別為HM585270-HM585879；P1、P4、Pns52、P91這4個蛋白主要定位于細胞質(zhì)，在細胞質(zhì)中形成聚集體，Pns52、Pns91能形成較大顆粒狀聚集體，而P1、P4則形成點狀的聚集體；P2、P8、P3、P10這4個蛋白的定位相似，即可定位于細胞核，也可以定位于細胞質(zhì)，在細胞質(zhì)中都能夠形成

6、一些點狀聚集體；P51、Pns6、Pns71、Pns72和Pns92定位相似，分散于整個細胞，定位于細胞質(zhì)中或膜上，沿細胞骨架等組分形成絲網(wǎng)狀結構，Pns6和 P51在細胞質(zhì)中還能夠形成顆粒狀的聚集體。
　　RT-PCR和實時定量PCR技術研究了病毒在水稻組織中的分布和動態(tài)變化以及種子各組分的帶毒情況。結果顯示：SRBSDV只存在于韌皮部細胞中，是一個韌皮部組織限制的病毒；不同生育期的病株種子各組分都可以帶毒，成熟種子雖可以攜帶S

7、RBSDV，但是不能夠經(jīng)過種子傳播；在水稻幼苗接種病毒后的30天內(nèi)，根組織的病毒含量一直大于地上部分組織，病毒含量在12天或14天內(nèi)增長比較緩慢，26 d左右時可達到比較明顯的水平；幼苗期根組織內(nèi)的病毒含量遠大于地上部分的葉片和葉鞘，而分蘗期根、葉、葉鞘、莖中的病毒含量差別不大，至揚花灌漿期后莖中的病毒含量遠大于其它部位，進一步說明病毒在不同生育期、不同組織中的含量是不同的。
　　最后，以SRBSDV Pns6為誘餌，利用酵母雙雜

8、交系統(tǒng)篩選水稻cDNA文庫，釣取了24個可能與之互作的水稻蛋白；從中選取8個蛋白，經(jīng)過RT-PCR獲得了其完整閱讀框，并將它們重組到酵母載體和BiFC植物表達載體上，通過酵母菌回復互作驗證和BiFC體系的熒光互補驗證，8個水稻蛋白中有5個能夠與Pns6互作，這5個水稻蛋白是40S ribosomal protein S9-2、ubiquitin-conjugating enzyme、AP2 domain containing prote

9、in、zinc finger protein、eukaryotic translation elongation factor1A。在此基礎上，進一步研究了OseEF1A(eukaryotic translation elongation factor1A from Oryza sativa)與SRBSDV Pns6互作的意義以及OseEF1A與水稻病毒互作的普遍性，取得了如下結果：（1）SRBSDV Pns6除了與水稻eEF1A互作外

10、，還與自身的基質(zhì)蛋白Pns91互作，共定位實驗表明Pns6可能招募Pns91和OseEF1A形成復合體，從而在病毒基因組復制和增殖中起某種作用；（2）RRSV的Pns10和Pns6都能夠與OseEF1A在酵母中互作以及在本氏煙細胞中共定位，說明和SRBSDV一樣，RRSV能夠利用OseEF1A為病毒基因組復制和增殖服務；（3）除上述兩種病毒外，OseEF1A還能夠與RGDV的Pns11，RSV的NS3，RGSV的NS1、NS3和PC3等