南方水稻黑條矮縮病毒非結(jié)構(gòu)蛋白P6是病毒復(fù)制的關(guān)鍵因子.pdf

1、南方水稻黑條矮縮病毒（SRBSDV）由介體白背飛虱傳播，不經(jīng)卵傳播。SRBSDV編碼的非結(jié)構(gòu)蛋白P5-1、P6和P9-1是病毒復(fù)制和裝配的場所—病毒原質(zhì)（viroplasm）的組分。這三種非結(jié)構(gòu)蛋白在病毒的復(fù)制過程中扮演著至關(guān)重要的作用。已知P6能分別與P5-1和P9-1互作，而P5-1和P9-1不能互作，那么這三種非結(jié)構(gòu)蛋白在病毒原質(zhì)的形成過程中是否由某一個蛋白起著決定性的作用，需要我們深入的研究。
　　本實驗首先通過免疫熒光標

2、記技術(shù)在介體白背飛虱培養(yǎng)細胞中觀察SRBSDV侵染后P5-1、P6和P9-1表達的先后順序，結(jié)果發(fā)現(xiàn)當SRBSDV侵染18 h時，P9-1沒有表達，P6的表達量稍多于P5-1，且以顆粒狀形態(tài)分布在細胞質(zhì)周圍；36 h時，P5-1和P6都大量表達，而此時P9-1也開始少量表達；隨著侵染時間的延長，P5-1，P6和P9-1的表達量都顯著升高；72 h時，三種非結(jié)構(gòu)蛋白均勻分布在細胞質(zhì)中。所以這三種蛋白表達的先后順序為P6, P5-1和P9-

3、1。
　　其次，利用RNAi（RNA interference）干擾和免疫熒光標記技術(shù)研究發(fā)現(xiàn)，分別干擾P5-1、P6和P9-1在白背飛虱培養(yǎng)細胞中的表達，均導致SRBSDV的侵染率顯著降低。同時，抑制P5-1表達后， P5-1和P9-1的表達量明顯降低，但是P6的表達量和對照組相當；抑制P6表達后，P5-1、P6和P9-1的表達量都顯著降低；抑制P9-1表達后，除了自身蛋白的表達量降低外，另外兩個蛋白的表達水平不受影響。dsRN

4、As降低了目標蛋白的轉(zhuǎn)錄和表達水平，并且干擾P6的表達對病毒復(fù)制的影響最大。實時熒光定量PCR（RT-qPCR）和Western blot的實驗結(jié)果也進一步證實了這一結(jié)論。
　　最后，構(gòu)建目的基因N端融合e-GFP或mCherry的重組桿狀病毒表達載體，當 SRBSDV P5-1-eGFP、P6-mCherry和P9-1-mCherry在Sf9細胞中單獨表達時，P5-1-eGFP彌散分布在細胞質(zhì)周圍，P6-mCherry和P9-1

5、-mCherry都以顆粒狀分布在細胞質(zhì)內(nèi)。當三種蛋白兩兩組合共同侵染時， P6-mCherry與P5-1-eGFP和P9-1-eGFP都會共定位，形成顆粒狀的病毒原質(zhì)，而這和實驗室構(gòu)建的桿狀病毒表達載體Bacmid-SRBSDV-P5-1、P6和P9-1侵染Sf9細胞的結(jié)果是一致的。這一結(jié)果也進一步說明P6在SRBSDV病毒原質(zhì)的形成過程中起到了其他蛋白無法代替的作用。
　　綜合以上結(jié)果，本實驗在細胞水平，通過觀察三種非結(jié)構(gòu)蛋白在

6、介體細胞中的表達順序，明確當SRBSDV侵染介體白背飛虱細胞后，P6最早表達，可能起重要的調(diào)控作用。借助于dsRNA誘導的RNAi、RT-qPCR和Western blot等技術(shù)手段證實了P6是病毒復(fù)制增殖過程中最關(guān)鍵的因子，啟動病毒原質(zhì)的形成，P6能夠招募P5-1和P9-1一起形成病毒原質(zhì)，P5-1和P9-1在病毒原質(zhì)中參與病毒基因組的復(fù)制和病毒粒體的裝配。因此，通過對P6的深入研究，有助于我們利用靶標基因找到防治水稻病毒病的方法，為