南方水稻黑條矮縮病毒基因序列特征及基質(zhì)蛋白與病毒防控藥劑相互作用研究.pdf

1、南方水稻黑條矮縮病毒(southern rice black-streaked dwarf virus,SRBSDV)是呼腸孤病毒科(Reoviridae)斐濟病毒屬(Fijivirus)第二組一個新成員。南方水稻黑條矮縮病毒引起的新水稻矮縮病近年在越南北部和我國南方各省爆發(fā)，給我國水稻生產(chǎn)帶來嚴重損失。尋找用于防控SRBSDV藥劑篩選的候選靶標，建立基于SRBSDV靶標蛋白的SRBSDV防控藥劑篩選模型，篩選出具有更高活性的抗SRBS

2、DV小分子化合物可為防治SRBSDV提供新的技術(shù)措施。本研究首先采用熒光定量PCR方法，對南方水稻黑條矮縮病毒的13個基因在水稻寄主中的豐度趨勢進行考察，了解SRBSDV的基因組組成。選取表達量較高的S9、S8以及S10三個基因為候選靶標，利用生物信息學研究了不同分離物基因組序列性質(zhì)，最終確定豐度最高且保守性最強的SRBSDV-P9-1基質(zhì)蛋白為研究靶標。結(jié)合生物信息學分析P9-1蛋白的氨基酸序列，發(fā)現(xiàn)了其氮端保守區(qū)、碳端保守區(qū)和131

3、~160 aa的高變區(qū)。繼而純化獲得了野生型(WT-His-P9-1)、碳端截短23個氨基酸(TR-ΔC23-His-P9-1)，氮端截短6個氨基酸(TR-ΔN6-His-P9-1)以及138位定點突變型(MU-138-His-P9-1)的SRBSDV-P9-1靶標蛋白。采用熒光滴定光譜法(fluorescence titration, FT)和微量熱泳動技術(shù)(microscale thermophoresis, MST)，在離體條件下

4、探究了毒氟磷(dufulin,DFL)與四種蛋白的相互作用，發(fā)現(xiàn)DFL與P9-1的結(jié)合常數(shù)為微摩爾級。同時，進行DFL抑制SRBSDV的作用機制研究，即通過與SRBSDV-P9-1的碳端23個氨基酸結(jié)合，抑制病毒基質(zhì)的形成。建立了基于SRBSDV-P9-1靶標蛋白來篩選新型病毒防控藥劑的作用模型。最后，基于建立的SRBSDV-P9-1靶標蛋白作用模型，進行DFL系列衍生物與蛋白的相互作用研究，篩選出結(jié)合作用更強的小分子化合物。具體結(jié)論如

5、下：
　　(1)SRBSDV基因在水稻體內(nèi)表達量分析
　　選取不同生長期、不同地區(qū)、不同品種及感染病毒狀況的SRBSDV水稻作為研究對象，采用熒光定量PCR法，對SRBSDV的13個基因片段的表達量進行分析。研究結(jié)果表明：S9-1、S7-1基因呈現(xiàn)高表達量特性及S6基因呈現(xiàn)最低表達量特性，均不受寄主生長期、地域、品種及病毒侵染狀態(tài)的影響；S8、S2基因呈現(xiàn)稍高的表達量；而其他基因片段如，S1、S3、S4、S5-1、S5-2、

6、S7-2、S9-2及S10則呈現(xiàn)不規(guī)律的表達趨勢。
　　(2)SRBSDV重要功能基因的生物信息學分析
　　利用分子生物學技術(shù)，結(jié)合生物信息學分析基因組核苷酸及氨基酸序列特征，明確不同分離物核苷酸序列的分類地位。對病毒基質(zhì)蛋白P9-1、外殼蛋白P10和核心蛋白P8進行理化性質(zhì)和功能預測等分析，確認各基因組的核苷酸全長、GC含量、親水區(qū)及疏水區(qū)、編碼蛋白的信號肽、二級及三級結(jié)構(gòu)等特征；利用Motif、Blast比對，對S8、S

7、9、S10序列進行同源性分析；結(jié)合SNP對S8、S9、S10的核苷酸序列進行突變分析，并結(jié)合建立的系統(tǒng)進化樹，進一步探索病毒的遺傳進化趨勢。
　　(3) SRBSDV-P9-1基質(zhì)蛋白的保守結(jié)構(gòu)域及高變結(jié)構(gòu)域分析
　　選擇S9基因組為研究對象，利用GeneDoc軟件分析SRBSDV及水稻黑條矮縮病毒(rice black streaked dwarf virus, RBSDV)P9-1序列的保守結(jié)構(gòu)域及高變結(jié)構(gòu)域，研究表明：

8、SRBSDV-P9-1與RBSDV-P9-1序列的碳端和氮端具有高度的保守性；同時SRBSDV-P9-1與RBSDV-P9-1序列之間存在一個高變區(qū)，即131~160 aa。
　　(4)野生型和突變型SRBSDV-P9-1基質(zhì)蛋白的表達與純化
　　基于SRBSDV-P9-1生物信息學研究結(jié)果，利用E. coli BL21(DE3) RIL表達菌株，成功表達和純化了野生型(WT-His-P9-1)及三種突變型基質(zhì)蛋白(TR-Δ

9、C23-His-P9-1、TR-ΔN6-His-P9-1以及MU-138-His-P9-1)。
　　(5)DFL及寧南霉素(ningnanmycin,NNM)與P9-1基質(zhì)蛋白相互作用研究
　　利用FT和MST技術(shù)研究了小分子化合物DFL、NNM與P9-1基質(zhì)蛋白的相互作用。研究結(jié)果表明：DFL與 WT-His-P9-1的結(jié)合力為1×105.061 M?1(FT)、3.26+/-0.46μM(MST)，NNM與WT-His-

10、P9-1的結(jié)合力為1×104.244 M?1(FT)、48.40+/-6.04μM(MST)，即DFL與P9-1基質(zhì)蛋白的結(jié)合力明顯強于NNM。為了探究DFL與P9-1的結(jié)合位點，利用FT和MST技術(shù)研究了DFL與TR-ΔC23-His-P9-1、TR-ΔN6-His-P9-1和MU-138-His-P9-1三種突變蛋白之間的結(jié)合作用力。研究結(jié)果表明：碳端23個氨基酸對于DFL與基質(zhì)蛋白的結(jié)合起到關(guān)鍵作用。在此基礎(chǔ)上，構(gòu)建了基于 WT-

11、His-P9-1、TR-ΔC23-His-P9-1蛋白的防控 SRBSDV活性小分子化合物作用模型。
　　(6)基于SRBSDV-P9-1基質(zhì)蛋白靶標模型的DFL衍生物的篩選
　　基于構(gòu)建的靶標蛋白作用模型，采用FT和MST技術(shù)手段，考察了DFL衍生物與WT-His-P9-1基質(zhì)蛋白的結(jié)合作用力。研究結(jié)果表明，芳雜環(huán)噻吩取代的化合物及苯環(huán)上沒有取代基、苯環(huán)引入?F、?Cl、?NO2、?CF3等六個DFL衍生物與WT-His-