原核表達(dá)雙鏈RNA抗水稻黑條矮縮病毒和水稻條紋病毒研究.pdf

1、水稻是一種重要的糧食作物，水稻的高產(chǎn)穩(wěn)產(chǎn)對(duì)于保障糧食安全有重要的戰(zhàn)略意義。水稻黑條矮縮病毒(Rice black-streaked dwarf disease, RBSDV)和水稻條紋病毒(Ricestripe virus，RSV)是危害水稻的兩種主要病毒病害，每年給水稻生產(chǎn)帶來(lái)巨大經(jīng)濟(jì)損失。目前我國(guó)水稻病毒病防治主要以化學(xué)防治為主。而化學(xué)防治又存在諸如農(nóng)藥殘留，污染生態(tài)環(huán)境和誘發(fā)傳毒介體抗藥性等問(wèn)題。RNA介導(dǎo)的病毒抗性(RNA-me

2、diated virusresistance)指依托于基因工程技術(shù)，構(gòu)建包含病毒基因發(fā)夾RNA的植物表達(dá)載體，轉(zhuǎn)化植物，以抵抗病毒侵染。目前利用該策略已轉(zhuǎn)化獲得多種抗病毒轉(zhuǎn)基因植物。RNA介導(dǎo)的病毒抗性具有表型近乎免疫、抗性持久、生物安全性高等特點(diǎn)。盡管如此，由于公眾出于對(duì)轉(zhuǎn)基因植物生態(tài)風(fēng)險(xiǎn)和食品安全性的考慮，抗病毒轉(zhuǎn)基因植物的應(yīng)用仍然受到極大地限制。用細(xì)菌等原核生物表達(dá)病毒dsRNA處理植物，通過(guò)RNA沉默技術(shù)抵御病毒侵染，為我們提供

3、另一條有效途徑。
　　本研究選取RBSDV和RSV的外殼蛋白基因(Coat Protein，CP)作為靶序列，利用PCR技術(shù)分別擴(kuò)增兩個(gè)CP基因的中間區(qū)域長(zhǎng)度為400 bp的cDNA片段，分別構(gòu)建發(fā)夾RNA(hpRNA)結(jié)構(gòu)的原核表達(dá)載體，轉(zhuǎn)入大腸桿菌M-JM109lacY菌株中，經(jīng)IPTG誘導(dǎo)，均可表達(dá)400bp的dsRNA。對(duì)單一變量溫度、IPTG終濃度、誘導(dǎo)時(shí)間進(jìn)行初步篩選，然后優(yōu)化組合三個(gè)變量，進(jìn)行誘導(dǎo)表達(dá)優(yōu)化實(shí)驗(yàn)。結(jié)果顯

4、示，dsRNA的最適表達(dá)條件是在0.4 mmol/L IPTG和32℃條件下，誘導(dǎo)3h，dsRNA的相對(duì)表達(dá)量最大。在病毒傳毒介體飛虱遷飛時(shí)期即秧田期，用稀釋不同倍數(shù)的表達(dá)載體菌液破碎液噴施水稻幼苗，進(jìn)行水稻田間病毒防效實(shí)驗(yàn)。統(tǒng)計(jì)結(jié)果顯示，噴施終濃度2.4×10-3μg/μLpGEM-RBSDVCP400表達(dá)載體菌液破碎液的水稻發(fā)病率為25.1％，噴施終濃度2.4×10-3μg/μL pGEM-RSVCP400 dsRNA表達(dá)載體菌液破