水稻條紋病毒OTU-like蛋白的研究.pdf

1、水稻條紋葉枯病是由灰飛虱(Laodelphax striatellus Fallén)傳播的水稻條紋病毒(Rice stripe virus，RSV)引起的病害。自19世紀(jì)末在日本發(fā)現(xiàn)后，該病害已在東南亞多個(gè)國(guó)家和地區(qū)數(shù)次大面積流行。RSV隸屬纖細(xì)病毒屬，其4條基因組RNA(RNA1-4)除RNA1含1個(gè)開放閱讀框(ORF)，其余3條(RNA2-4)均含有2個(gè)ORF。其中RSV RNA1編碼1個(gè)由2919aa組成的多肽(PC1)，總的分

2、子量約337kDa。序列分析顯示該多肽具有RNA依賴性RNA聚合酶(RdRp)功能結(jié)構(gòu)域，因此被認(rèn)為是RSV RdRp。其N-端區(qū)域還存在一個(gè)OTU-like(ovarian tumor-like domain)結(jié)構(gòu)域。OTU-like蛋白酶家族是去泛素化酶(deubquitinating enzymes，DUBs)家族中的一大類。此類蛋白酶可通過去泛素化作用，在病毒與宿主互作過程中起重要作用。之前本實(shí)驗(yàn)室的研究表明RSV PC1 N-

3、端部分可能在病毒RdRp的成熟過程及與宿主的互作過程中起作用。本研究首先將RSV PC1 N-端OTU-like蛋白的編碼區(qū)分成4段，分別克隆至原核表達(dá)載體pET-32a，并導(dǎo)入Ecoli.BL21(DE3)，使用IPTG誘導(dǎo)表達(dá)。原核表達(dá)的融合蛋白用于免疫小鼠，制備抗血清。Western blotting分析顯示所制備的抗血清對(duì)所表達(dá)的蛋白具有特異性的。同時(shí)，我們利用酵母載體質(zhì)粒pGBKT7構(gòu)建了含有RSV PC1 OTU-like蛋

4、白編碼區(qū)的重組誘餌質(zhì)粒，即pGBK-OTU。自激活分析顯示該蛋白無自激活活性。以此為誘餌，通過Mating實(shí)驗(yàn)篩選水稻cDNA表達(dá)文庫(kù)，共篩選獲得了3個(gè)與該OTU蛋白相互作用的水稻因子。雙分子熒光互補(bǔ)(Bimolecular fluorescence complementation，BiFC)實(shí)驗(yàn)顯示在植物細(xì)胞中RSVOTU-like蛋白與水稻LHCP存在強(qiáng)烈的互作。通過病毒誘導(dǎo)基因沉默(VIGS)技術(shù)下調(diào)LHCP基因的表達(dá)可引發(fā)明顯的