臭椿粗提物對水稻條紋病毒在水稻懸浮細(xì)胞中的作用機(jī)制.pdf

1、近年來，水稻條紋葉枯病在各地爆發(fā)流行，給農(nóng)業(yè)生產(chǎn)造成了嚴(yán)重的危害，在農(nóng)業(yè)生產(chǎn)中還缺乏有效的防治藥劑，因此篩選有效的病毒抑制劑并探索其作用機(jī)制，在研發(fā)水稻條紋病毒抑制劑過程中占有非常重要的位置。 本研究以對水稻條紋病毒(RSV)感病的品種(武育粳3號)為材料建立水稻懸浮細(xì)胞體系，應(yīng)用PEG介導(dǎo)與漩渦振蕩相結(jié)合，將RSV接種到水稻懸浮細(xì)胞，用間接熒光抗體檢測，在熒光倒置顯微鏡下觀察RSV侵染水稻懸浮細(xì)胞的侵染率為30％-35％，采用

2、酶聯(lián)免疫吸附法(ELISA)檢測病毒在懸浮細(xì)胞內(nèi)的增殖周期，接種12h后外殼蛋白(CP)含量在細(xì)胞體內(nèi)迅速增長，30h左右在細(xì)胞內(nèi)的含量達(dá)到最大值，隨后逐漸下降。 利用懸浮細(xì)胞體系，建立病毒-細(xì)胞-藥劑篩選體系，對已知的幾種抗病毒藥物進(jìn)行篩選試驗(yàn)，采用酶聯(lián)免疫吸附法(ELISA)和蛋白免疫雜交法(western-blot)對其抑制效果進(jìn)行檢測，發(fā)現(xiàn)臭椿粗提物對RSV有一定的抑制作用，抑制率為80％-90％；直接把病毒和臭椿粗提物

3、混合，不同時間取樣，用SDS．聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS-PAGE)法檢測了臭椿粗提物對CP的抑制效果，發(fā)現(xiàn)臭椿粗提物并不是直接對該病毒蛋白起降解作用；利用地高辛(DIG)標(biāo)記，制備CP、SP基因的核酸探針，分別進(jìn)行Northern-blot點(diǎn)雜交分析，發(fā)現(xiàn)臭椿粗提物對病毒mRNA在細(xì)胞體內(nèi)的轉(zhuǎn)錄影響不大；但同時利用Real-Time PCR分析，發(fā)現(xiàn)臭椿粗提物能顯著降低SP基因在細(xì)胞體內(nèi)的轉(zhuǎn)錄，還能微量減少CP基因在細(xì)胞體內(nèi)的轉(zhuǎn)錄。通

4、過對病毒．寄主互作中有關(guān)主要防御酶(過氧化物酶(POD)、多酚氧化酶(PPO)和苯丙氨酸解氨酶(PAL))的酶活性測定，發(fā)現(xiàn)臭椿粗提物能使POD、PPO、PAL三種主要防御酶的酶活性增強(qiáng)，這表明臭椿提取物可能使寄主產(chǎn)生誘導(dǎo)抗性，能激發(fā)寄主產(chǎn)生與抗病有關(guān)的防衛(wèi)反應(yīng)。 臭椿粗提物對RSV的作用機(jī)制可能表現(xiàn)在：臭椿粗提物不是對細(xì)胞內(nèi)的CP直接起降解作用，細(xì)胞體內(nèi)病毒蛋白含量的減少，可能是臭椿粗提物使寄主一些主要防御酶的酶活性增強(qiáng)，阻斷