基于miRNA和siRNA策略抗水稻條紋病毒和水稻黑條矮縮病毒的研究.pdf

1、水稻是我國重要的糧食作物之一，種植面積約占糧食播種總面積的30％，產(chǎn)量接近糧食總產(chǎn)量的44%。稻米品質(zhì)好，價值高，是我國主要的商品糧食，亦是發(fā)酵工業(yè)的重要原料。水稻病害是限制水稻進(jìn)一步提高產(chǎn)量和品質(zhì)的主要瓶頸之一。水稻條紋葉枯?。≧ice stirp disease）和水稻黑條矮縮?。≧ice black-streaked dwarf disease）是在水稻生產(chǎn)中普遍發(fā)生的、危害嚴(yán)重的病毒病害。發(fā)病嚴(yán)重時，感病植株死亡，最終導(dǎo)致水稻產(chǎn)

2、量明顯降低，甚至絕產(chǎn)；即使存活到成熟，也表現(xiàn)為生長嚴(yán)重受阻，對水稻生產(chǎn)造成嚴(yán)重?fù)p失；并且兩種病毒病均是由灰飛虱持久性傳播的，在田間，這兩種病害可以同時發(fā)生，加重發(fā)病癥狀，對水稻生產(chǎn)造成更加嚴(yán)重的危害。
　　RNA沉默（RNA silencing）是一種廣泛存在于植物、動物、線蟲和真菌等真核生物中，由雙鏈RNA（double strand RNA，dsRNA）引發(fā)的，通過序列特異性的相互作用來抑制基因表達(dá)的現(xiàn)象，被認(rèn)為是真核生物阻止

3、病毒、轉(zhuǎn)座子等外來核酸的入侵，維持生物基因組穩(wěn)定性的重要防御機(jī)制。其中，小干擾RNA（small interfering RNA，siRNA）和微小RNA（microRNA，miRNA）是沉默RNA的最主要組成部分。利用RNA干擾技術(shù)培育抗病毒的轉(zhuǎn)基因植物是目前常用的一種抗病毒基因工程策略，通常稱為RNA介導(dǎo)的病毒抗性（RNA-mediated virus resistance，RMVR）。其中，利用人工合成microRNA（artif

4、icial miRNA，amiRNA）的RNA介導(dǎo)病毒抗性策略培育抗病毒轉(zhuǎn)基因植物取得了很大進(jìn)展，具有抗性表型近乎免疫、抗性持久、生物安全性高等特點(diǎn)，被認(rèn)為是一種具有較大應(yīng)用價值的植物抗病毒基因工程策略。此外，隨著對RNA介導(dǎo)的病毒抗性的不斷研究，利用RNAi策略防治病毒病已經(jīng)不止局限于培育獲得高病毒抗性的轉(zhuǎn)基因植物。目前，有研究表明，給傳毒昆蟲介體飼喂dsRNA，可以使昆蟲介體失去傳毒能力。這種防控病毒病的方法主要是切斷植物病毒的傳播

5、途徑，不需要產(chǎn)生轉(zhuǎn)基因植物就可以達(dá)到防治病毒的目的，更加具有生物安全性。
　　本研究以水稻條紋病毒（Rice stripe virus，RSV）和水稻黑條矮縮病毒（Rice black-streaked dwarf virus，RBSDV）為實(shí)驗(yàn)材料，利用嵌合人工miRNA策略，培育獲得了具有較高抗病水平且能夠穩(wěn)定遺傳的雙抗RSV和RBSDV轉(zhuǎn)基因水稻新材料；以灰飛虱和RSV為實(shí)驗(yàn)材料，利用RNA沉默技術(shù)，對可能參與昆蟲介體傳播病

6、毒的相關(guān)蛋白進(jìn)行了功能驗(yàn)證，在此基礎(chǔ)上，利用RNAi對昆蟲體內(nèi)的傳毒相關(guān)蛋白進(jìn)行基因沉默，阻斷昆蟲對病毒的傳播，減輕病毒對作物的危害。雙抗病毒轉(zhuǎn)基因水稻新材料的獲得，為我們進(jìn)一步將現(xiàn)代生物技術(shù)與傳統(tǒng)育種技術(shù)相結(jié)合培育抗病毒水稻新品種奠定了基礎(chǔ)；介體傳毒相關(guān)蛋白的鑒定，為我們進(jìn)一步高效地利用RNA沉默技術(shù)控制病毒病的危害提供重要依據(jù)。主要研究結(jié)果和結(jié)論如下：
　　（1）基于amiRNA策略培育雙抗RSV和RBSDV轉(zhuǎn)基因水稻新材料<

7、br>　　基于amiRNA抗病毒策略，選取水稻內(nèi)源的osa-MIR528作為前體，利用WMD網(wǎng)站設(shè)計靶向于RSV及RBSDV的CP基因及其3′-UTR區(qū)上的有效amiRNA；然后選擇了分別靶向于RSV和RBSDV的CP基因中間片段、3′端、3′-UTR區(qū)域的3個amiRNA（分別命名為 amiR-RSVM，amiR-RSV3，amiR-RSVU和amiR-RBSDVM，amiR-RBSDV3，amiR-RBSDVU）。利用重疊PCR（o

8、verlap PCR）將其替換掉osa-MIR528自身的miRNA有效片段；然后嵌合連入改造好的pCAMBIA1300表達(dá)載體，獲得了能同時靶向于RSV和RBSDV的3個amiRNA前體二聚體植物表達(dá)載體（pamiR-M，pamiR-3和pamiR-U）。
　　將構(gòu)建好的3個植物表達(dá)載體導(dǎo)入農(nóng)桿菌EHA105，瞬時侵染本生煙驗(yàn)證其有效性，3d后amiRNA的Northern分析結(jié)果表明，構(gòu)建好的amiRNA植物表達(dá)載體在侵染的本

9、生煙體內(nèi)能有效地表達(dá)，產(chǎn)生成熟的amiRNA，并下調(diào)靶基因的表達(dá)。5′-RLM-RACE實(shí)驗(yàn)表明，amiRNA能精確介導(dǎo)靶基因序列的剪切。
　　通過農(nóng)桿菌介導(dǎo)的基因轉(zhuǎn)化方法轉(zhuǎn)化臨稻10愈傷組織，經(jīng)除草劑PPT篩選和PCR檢測，分別獲得含有pamiR-M，pamiR-3和pamiR-U的T0代轉(zhuǎn)基因植株為35株、37株、48株；轉(zhuǎn)基因植株內(nèi)，各類改造后的pre-amiRNA均能被識別，并表達(dá)產(chǎn)生成熟的amiRNA。
　　T0代

10、轉(zhuǎn)基因植株經(jīng)過連續(xù)自交，結(jié)合除草劑抗性檢測和PCR鑒定，獲得T2代植株。T2代轉(zhuǎn)基因植株病毒抗性鑒定結(jié)果顯示，各轉(zhuǎn)基因株系都表現(xiàn)出了對 RSV和RBSDV的不同程度的抗性，包含pamiR-M，pamiR-3和pamiR-U的轉(zhuǎn)基因株系對RSV的抗病率分別為29.52%，44.14%和54.17%；對 RBSDV的抗病率分別為26.66%，36.04%和45.83%。
　　對獲得的轉(zhuǎn)基因植株進(jìn)行Southern和Northern雜交

11、分析，結(jié)果表明，外源基因以不同的拷貝數(shù)整合到了水稻基因組中。在轉(zhuǎn)基因植株中靶病毒 RNA的下調(diào)是由初級的amiRNA介導(dǎo)所誘發(fā)的，并且沉默可以通過siRNA途徑向雙邊延長，初級的amiRNA和次級的siRNA共同介導(dǎo)轉(zhuǎn)基因植株對病毒的抗性。遺傳穩(wěn)定性分析表明轉(zhuǎn)基因和其介導(dǎo)的病毒抗性能在轉(zhuǎn)基因植株中穩(wěn)定遺傳。
　　（2）介體傳毒相關(guān)蛋白的鑒定及干擾基因的表達(dá)對介體傳毒的影響
　　以已報道的灰飛虱體內(nèi)與RSV互作的蛋白基因NCu

12、P作為候選基因，設(shè)計引物，利用RT-PCR克隆得到目的基因。利用qRT-PCR技術(shù)，研究灰飛虱NCuP在介體的不同發(fā)育階段的表達(dá)特性，發(fā)現(xiàn)其在灰飛虱的整個發(fā)育過程中均有表達(dá)，但不同發(fā)育時期的表達(dá)是存在差異的，1齡若蟲的NCuP表達(dá)量最高，隨著昆蟲的生長其表達(dá)量逐漸降低。qRT-PCR檢測RSV的侵染對不同齡期灰飛虱NCuP表達(dá)的影響，結(jié)果顯示，帶毒灰飛虱體內(nèi)的NCuP的表達(dá)水平明顯高于無毒灰飛虱體內(nèi)的NCuP的表達(dá)水平，初步表明NCuP

13、可能參與了RSV在介體內(nèi)的繁殖傳播。
　　體外合成NCuP的dsRNA，飼喂帶RSV的灰飛虱，利用qRT-PCR檢測靶基因及病毒基因在昆蟲體內(nèi)的表達(dá)情況，結(jié)果顯示，飼喂dsNCuP的灰飛虱體內(nèi)NCuP的表達(dá)水平和RSV的積累水平均有顯著降低，推測NCuP可能參與了RSV在介體內(nèi)的繁殖。對飼喂dsNCuP的灰飛虱進(jìn)行獲毒率和傳毒率的檢測發(fā)現(xiàn)，對照組的獲毒率和傳毒率分別為41.44%和68.33%，而飼喂 dsNCuP的灰飛虱的獲毒率