水稻條紋病毒病程相關(guān)蛋白SP寄主互作因子的分離鑒定及水稻齒輪葉矮縮病毒單克隆抗體的制備和應用.pdf

1、水稻條紋病毒（Rice stripe virus，RSV）近年來嚴重影響了我國水稻的產(chǎn)量。該病毒是纖細病毒屬(Tenuivirus)的典型成員，病毒粒子為絲狀體，介體昆蟲為灰飛虱(Laodelphax Striatellus Fallen)，以持久循回增殖型的方式進行傳播。為了分析水稻條紋病毒的致病機理，本文對與水稻條紋病毒病程相關(guān)蛋白SP互作的寄主因子進行分離、鑒定。
　　 用酵母雙雜交的方法分離寄主互作因子，即誘餌質(zhì)粒pGB

2、KT7-SP和水稻cDNA文庫的質(zhì)粒pGADT7-Rec-cDNA共轉(zhuǎn)化酵母菌株Y2H Gold，通過三缺和四缺營養(yǎng)缺陷型培養(yǎng)基上的生長情況，初步選定寄主互作因子基因片段。寄主因子基因片段經(jīng)測序分析，并進一步進行回轉(zhuǎn)驗證，鑒定了與SP互作的R3H domain蛋白為候選水稻寄主因子。從健康水稻葉片中克隆了這個基因的全長序列后，構(gòu)建酵母雙雜交載體pGBKT7-SP與pGADT7-R3H，將兩個質(zhì)粒共轉(zhuǎn)化酵母菌株Y2H Gold后，發(fā)現(xiàn)R3

3、H domain蛋白能在酵母營養(yǎng)缺陷培養(yǎng)基上生長，說明SP蛋白和R3H domain蛋白之間互作。同時構(gòu)建了雙分子熒光互補實驗(Bimolecularfluorescence complementation，BiFC)的重組質(zhì)粒YFPN-SP和YFPC-R3H，轉(zhuǎn)化農(nóng)桿菌C58C1后，浸潤本氏煙葉片后，共聚焦顯微鏡下有明顯的黃色熒光，證實SP和R3H domain蛋白可以在煙草細胞中互作。R3H dmain蛋白的分離、鑒定為弄清RSV的

4、致病機理打下基礎(chǔ)。
　　 水稻齒葉矮縮病毒(Rice ragged stunt virus，RRSV)是呼腸弧病毒科(Reoviridae)水稻病毒屬(Oryzavirus)的成員，引起水稻齒葉矮縮病，目前嚴重影響我國的水稻生產(chǎn)。該病毒的傳播介體是褐飛虱(Nilaparvata lugens)，其以持久方式進行傳播。
　　 從感染RRSV的水稻葉片中提取水稻總RNA，用RT-PCR方法克隆了RRSV的衣殼蛋白基因(CP)

5、后構(gòu)建到原核表達載體pMAL-C2X上，構(gòu)建成重組表達載體pMAL-C2X-CP，pMAL-C2X-CP轉(zhuǎn)化入大腸桿菌表達菌株BL21(DE3)，經(jīng)0.5mM IPTG37℃誘導3小時表達重組蛋白。表達的重組融合蛋白經(jīng)AmyloseResin親和層析柱純化后，獲得RRSV的80KD左右的重組融合外殼蛋白。用得到的重組蛋白免疫老鼠，取免疫老鼠的脾臟細胞和SP2/0細胞融合，經(jīng)過細胞篩選、克隆后得到1株能夠穩(wěn)定分泌抗體的雜交瘤細胞株4H5，