水稻條紋病毒NS2、NS3蛋白與寄主間的互作.pdf

1、水稻條紋病毒(Rice stripe virus,RSV)是纖細(xì)病毒屬的代表種,由RSV引起的水稻條紋葉枯病近年來(lái)在我國(guó)多次爆發(fā)流行,給我國(guó)的水稻生產(chǎn)造成了嚴(yán)重的經(jīng)濟(jì)損失。經(jīng)過(guò)國(guó)內(nèi)外學(xué)者多年來(lái)的研究,RSV編碼蛋白的功能、致病性分化、遺傳多樣性、病毒與寄主間的互作以及病害的防治都有了一定的認(rèn)識(shí)。為了控制病害的發(fā)生,促進(jìn)我國(guó)水稻生產(chǎn)的可持續(xù)發(fā)展,需要深入地了解病毒與水稻、介體昆蟲(chóng)三者之間的互作關(guān)系。
　　 本文利用酵母雙雜交技術(shù)研

2、究了RSVNS2、NS3蛋白與寄主水稻間的互作,獲得了一些陽(yáng)性克隆。為進(jìn)一步確定獲得的陽(yáng)性克隆基因所編碼的全長(zhǎng)蛋白是否能與NS2或NS3互作,選取了與NS2互作的5個(gè)基因,與NS3互作的3個(gè)基因片段進(jìn)行全長(zhǎng)擴(kuò)增,并構(gòu)建至酵母表達(dá)載體pGADT7,分別與NS2或NS3共轉(zhuǎn)化酵母菌AH109,通過(guò)不同的營(yíng)養(yǎng)缺陷型培養(yǎng)基篩選,確定全長(zhǎng)蛋白與NS2或NS3互作情況。結(jié)果表明,完整水稻果膠酶蛋白(pectinesterase)、Ras相關(guān)蛋白(r

3、as-related protein)、膽堿磷酸胞苷酰轉(zhuǎn)移酶(cholinephosphatecytidylyltransferase)、水稻基因沉默抑制子3(suppressor of gene silencing3,SGS3)及一功能未知蛋白均能與NS2互作,完整水稻UBA/TS-N域包含蛋白(UBA/TS-Ndomain containing protein)、3-磷酸甘油醛脫氫酶(glyceraldehyde-3-phospha

4、tedehydrogenase,GAPDH)能夠與NS3互作,而完整蛋白O-甲基轉(zhuǎn)移酶(O-methyltransferase)不能與NS3互作,且水稻SGS3(OsSGS3)蛋白也能夠與NS3互作。水稻SGS3(OsSGS3)蛋白與擬南芥SGS3蛋白同源,為研究NS2、NS3與水稻SGS3互作的關(guān)鍵區(qū)段,根據(jù)OsSGS3的保守結(jié)構(gòu)域?qū)⑵浞譃?段,分別為包含Zinc結(jié)構(gòu)域的SGS3-1區(qū)段、包含XS結(jié)構(gòu)域的SGS3-2區(qū)段、包含Coil

5、ed coil結(jié)構(gòu)域的SGS3-3區(qū)段,并與NS2或NS3共轉(zhuǎn)化酵母菌AH109,通過(guò)不同的營(yíng)養(yǎng)缺陷型培養(yǎng)基篩選互作的區(qū)段。結(jié)果表明NS2、NS3均可以與這3個(gè)區(qū)段互作,但NS2與SGS3-3區(qū)段的互作較弱。
　　 雙分子熒光互補(bǔ)研究表明在煙草葉片細(xì)胞中NS3與水稻GAPDH(OsGAPDH)、NS2與OsSGS3存在的互作。亞細(xì)胞定位研究表明OsGAPDH主要定位于細(xì)胞質(zhì)中,OsSGS3定位于細(xì)胞質(zhì),而NS2定位于細(xì)胞核和細(xì)胞

6、膜,且在膜上形成小點(diǎn)結(jié)構(gòu),在核內(nèi)能定位于柯浩體。OsSGS3與NS2主要共定位于細(xì)胞核,推測(cè)NS2改變了OsSGS3的定位,進(jìn)而干擾其功能。免疫共沉淀結(jié)果也表明NS2與OsSGS3存在互作。擬南芥SGS3在小RNA生成過(guò)程中發(fā)揮作用,為研究NS2與OsSGS3互作的可能功能,首先通過(guò)熒光定量PCR檢測(cè)了相關(guān)反式作用小RNA的靶標(biāo)基因(5個(gè)生長(zhǎng)素應(yīng)答因子)表達(dá)量變化。結(jié)果表明,RSV侵染水稻后5個(gè)生長(zhǎng)素應(yīng)答因子表達(dá)量上調(diào),表明RSV侵染后

7、水稻反式作用小RNA途徑可能受到影響。為此進(jìn)一步檢測(cè)了相應(yīng)反式作用小RNA的表達(dá)量變化,結(jié)果表明小RNA表達(dá)量相對(duì)于健康水稻上升了2倍,推測(cè)可能是水稻的反饋調(diào)節(jié)作用造成的。進(jìn)一步對(duì)OsSGS3、反式作用siRNA前體TAS3基因表達(dá)量進(jìn)行了檢測(cè),結(jié)果表明OsSGS3基因表達(dá)量上調(diào)了2.7倍,TAS3基因表達(dá)量上調(diào)了3倍。
　　 以灰飛虱(Laodelphax striatellus)mRNA為起始模板,利用Gateway技術(shù)構(gòu)建

8、了灰飛虱酵母雙雜交cDNA文庫(kù)。經(jīng)過(guò)檢測(cè)表明:構(gòu)建的初級(jí)cDNA文庫(kù)的庫(kù)容量為1.85x107cfu;擴(kuò)增文庫(kù)滴度為7.7x108cfu/mL,重組率約為97％;擴(kuò)增文庫(kù)插入片段主要集中在1000-1500 bp之間。隨機(jī)挑取10個(gè)克隆,測(cè)序后與GenBank數(shù)據(jù)庫(kù)比對(duì)結(jié)果顯示7個(gè)克隆具有同源序列,其中L2、L9為已公布的灰飛虱序列?；绎w虱酵母雙雜交cDNA文庫(kù)的構(gòu)建為克隆全長(zhǎng)目的基因及研究灰飛虱與其傳播的水稻病毒問(wèn)的互作奠定了基礎(chǔ)。構(gòu)

9、建了包含RSV NS3的酵母表達(dá)載體pDB-NS3,以NS3為誘餌篩選了灰飛虱cDNA文庫(kù),釣取與之互作的灰飛虱蛋白。首先將酵母表達(dá)載體pDB-NS3轉(zhuǎn)化酵母菌MaV203,以含有pDB-NS3的酵母菌制備酵母感受態(tài),采用順序轉(zhuǎn)化法篩選灰飛虱cDNA文庫(kù),轉(zhuǎn)化產(chǎn)物分別涂布不同的營(yíng)養(yǎng)缺陷型培養(yǎng)基,觀察酵母菌生長(zhǎng)情況并檢測(cè)B半乳糖苷酶活性。結(jié)果表明,以NS3為誘餌共篩選獲得4個(gè)陽(yáng)性克隆,序列比對(duì)表明只有一個(gè)克隆具有正確讀碼框,且與一些昆蟲(chóng)的