丙型肝炎病毒NS5A不同免疫源區(qū)及NS3的表達(dá)與檢測(cè)評(píng)估.pdf

1、丙型肝炎病毒(Hepatitis C Virus，簡(jiǎn)稱HCV)的非結(jié)構(gòu)蛋白3(non-structuralprotein 3 NS3)和非結(jié)構(gòu)蛋白5A(non-structural protein 5A NSSA)分別為HCV診斷第二代、第三代酶聯(lián)免疫吸附實(shí)驗(yàn)(enzyme.1inked immunosorbent assay ELISA)所必需的片段，對(duì)于HCV臨床診斷有重要意義。本研究通過(guò)基因工程方法得到丙型肝炎病毒NSSA的長(zhǎng)短兩

2、片段與NS3的全長(zhǎng)序列，并進(jìn)行了初步的免疫學(xué)檢測(cè)鑒定。 以含丙型肝炎病毒全基因的質(zhì)粒pBRtm/HCV-3011(1b型)為模板，經(jīng)PCR方法擴(kuò)增出編碼丙型肝炎病毒的第三代抗.HCV酶聯(lián)免疫吸附實(shí)驗(yàn)所需全長(zhǎng)NS5A和高免疫源區(qū)NSSA蛋白(氨基酸2212.2313)的基因，分別命名為NS5AL和NSSAS，克隆入pET-32a載體中，成功構(gòu)建重組表達(dá)載體pET-NS5AL和pET-NS5AS，將pET-NS5AL轉(zhuǎn)化大腸桿菌Ro

3、setta(DE3)pLsS、pET-NS5AS轉(zhuǎn)化大腸桿菌BL21(DE3)，成功構(gòu)建工程菌，分別命名為Rosetta(DE3)pLysS-NS5AL、BL21(DE3)-NS5AS，經(jīng)IPTG誘導(dǎo)，SDS.PAGE分析NS5AL出現(xiàn)一條約68kDa的條帶，NS5AS出現(xiàn)一條約39kDa的條帶，與預(yù)期融合蛋白的分子量相符，Western-blot顯示誘導(dǎo)后的菌體在相應(yīng)的位置出現(xiàn)特異性的雜交帶，通過(guò)Ni-NTAAgarose純化重組蛋白

4、，得到了濃度分別為0.146mg/mL、0.426mg/mL，純度超過(guò)96％的目的蛋白，選擇5例確診HCV感染者的陽(yáng)性血清，通過(guò)ELISA對(duì)重組蛋白NS5AL與NS5AS的檢測(cè)性進(jìn)行鑒定，并比較兩重組蛋白的檢測(cè)靈敏度，ELISA結(jié)果表明：重組蛋白NS5AL與NS5AS都具有良好的免疫學(xué)檢測(cè)效果，且重組蛋白NS5AL的檢測(cè)靈敏度明顯高于NS5AS。 將克隆有NS3基因的重組質(zhì)粒pProEX-HTb-NS3轉(zhuǎn)化BL21(DE3)，成

5、功構(gòu)建工程菌BL21(DE3)-NS3，IPTG誘導(dǎo)表達(dá)NS3蛋白，進(jìn)行SDS-PAGE與Western-Blot分析，NS3出現(xiàn)一條約為72kDa的條帶，Ni-NTA agarose純化重組蛋白NS3，得到了濃度為0.346mg/mL、純度超過(guò)93％的重組蛋白NS3，ELISA方法證明了純化后的蛋白具有良好的免疫學(xué)檢測(cè)效果。 本研究運(yùn)用原核表達(dá)體系，成功地得到了NSSA蛋白的長(zhǎng)短片段和全長(zhǎng)的NS3蛋白。ELISA結(jié)果表明NS3