HCV NS5A及其反式激活基因NS5ATP9對(duì)肝細(xì)胞凋亡的影響及機(jī)制研究.pdf

1、第一部分
　　 HCV(Ib型)NS5A真核表達(dá)載體構(gòu)建及凋亡相關(guān)基因表達(dá)譜芯片分析
　　 目的：構(gòu)建HCV(Ib型)NS5A真核表達(dá)載體pcDNA3.1/myc-His(-)-HCVNS5A，研究NS5A蛋白對(duì)人肝癌細(xì)胞凋亡相關(guān)分子表達(dá)的影響。
　　 方法：以丙肝患者血清HCV RNA（Ib型）為模板，逆轉(zhuǎn)錄PCR法獲取NS5A基因序列，再將該基因連到pGEM-TEasy載體上，經(jīng)XhoⅠ和HindⅢ雙酶切獲得

2、NS5A粘性末端，將NS5A粘性末端與同樣經(jīng)XhoⅠ和HindⅢ雙酶切的pcDNA3.1/myc-His(-)連接從而構(gòu)建成NS5A的真核表達(dá)載體。用Western blot法鑒定NS5A基因在人肝癌細(xì)胞系HepG2中的表達(dá)。將轉(zhuǎn)染了pcDNA3.1/myc-His(-)-HCV NS5A的HepG2進(jìn)行表達(dá)譜芯片分析。
　　 結(jié)果：構(gòu)建的真核表達(dá)載體經(jīng)雙酶切及測(cè)序鑒定正確無誤，轉(zhuǎn)染HepG2細(xì)胞系后Western blot檢測(cè)

3、顯示HepG2大量表達(dá)myc-his-NS5A融合蛋白。芯片分析顯示11條與凋亡相關(guān)的基因出現(xiàn)差異表達(dá)其中5條基因表達(dá)上調(diào)，6條表達(dá)下調(diào)。
　　 結(jié)論：成功構(gòu)建了Ib型HCV NS5A的真核表達(dá)載體，利用表達(dá)譜芯片分析發(fā)現(xiàn)NS5A對(duì)肝細(xì)胞凋亡的作用可能涉及死亡受體通路、線粒體凋亡通路、DNA修復(fù)機(jī)制。
　　 第二部分
　　 NS5ATP9抑制血清饑餓誘導(dǎo)的HepG2細(xì)胞凋亡
　　 目的：探討HCV NS5

4、A反式激活基因NS5ATP9對(duì)肝癌細(xì)胞系HepG2細(xì)胞凋亡的影響。
　　 方法：將NS5ATP9基因表達(dá)質(zhì)粒、NS5ATP9干擾RNA質(zhì)粒及各自的對(duì)照空質(zhì)粒轉(zhuǎn)染到HepG2細(xì)胞系,48h后換無血清培養(yǎng)基培養(yǎng)24h誘導(dǎo)凋亡，用實(shí)時(shí)熒光定量PCR驗(yàn)證轉(zhuǎn)染后NS5ATP9 mRNA表達(dá)水平的變化，用Annexin V/7AAD流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)細(xì)胞凋亡，JC-1檢測(cè)線粒體膜電位，Western blot技術(shù)檢測(cè)Bax蛋白表達(dá)，以觀察NS5

5、ATP9對(duì)HepG2細(xì)胞血清饑餓誘導(dǎo)凋亡的影響。
　　 結(jié)果：Annexin V/7AAD檢測(cè)結(jié)果顯示，NS5ATP9過表達(dá)組和對(duì)照組相比早期凋亡和總凋亡率顯著減少（P＜0.05）；而NS5ATP9干擾RNA組的早期凋亡、晚期凋亡和總凋亡率均顯著增加(P＜0.05)。JC-1檢測(cè)結(jié)果顯示，NS5ATP9過表達(dá)組和對(duì)照組相比線粒體膜電位保持正常形式的比例增加（P=0.053），而出現(xiàn)去極化電位形式的比例顯著減少（P＜0.05），△

6、ψm有增高趨勢(shì)（P=0.324）；而NS5ATP9干擾RNA組線粒體膜電位保持正常形式的比例顯著減少(P＜0.05)，AVm有降低趨勢(shì)（P=0.378）。促凋亡分子Bax蛋白Western blot檢測(cè)結(jié)果顯示，NS5ATP9干擾RNA組Bax表達(dá)量顯著上升(P＜0.05)，NS5ATP9過表達(dá)組Bax表達(dá)量則有下降趨勢(shì)（P=0.551）。
　　 結(jié)論：NS5ATP9基因抑制血清饑餓誘導(dǎo)的HepG2凋亡，其機(jī)制可能是通過線粒體途