HCV NS5A對(duì)TLR3、TLR4表達(dá)的影響.pdf

1、目的：丙型肝炎病毒(Hepatitis C virus,HCV)感染呈全球性流行發(fā)展,是歐美及日本等國(guó)家終末期肝臟疾病的主要原因之一。目前,全球HCV的感染率約為3％,大約1.7億人感染HCV,每年新發(fā)丙型肝炎病例達(dá)到3.5萬(wàn)例。我國(guó)HCV感染率為1.5～3.5％,總體感染人群3000萬(wàn)以上。HCV感染后約80％成為慢性持續(xù)狀態(tài),慢性感染可導(dǎo)致肝臟慢性炎癥壞死和纖維化,甚至可發(fā)展為肝硬化及肝細(xì)胞癌,對(duì)患者的健康和生命危害非常大,已成為嚴(yán)

2、重的社會(huì)和公共衛(wèi)生問(wèn)題。丙型肝炎病毒非結(jié)構(gòu)蛋白NS5A作為重要的非結(jié)構(gòu)蛋白,近年來(lái)有關(guān)它的研究倍受關(guān)注,它具有抗凋亡、轉(zhuǎn)錄激活作用、干擾細(xì)胞內(nèi)信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路、調(diào)解病毒復(fù)制水平等多項(xiàng)生物學(xué)活性,提示其在干擾素療效預(yù)測(cè)、病毒復(fù)制、細(xì)胞凋亡、肝細(xì)胞癌發(fā)生等多方面均具有重要作用。目前關(guān)于TLRs與機(jī)體相互作用的機(jī)制成為研究熱點(diǎn)之一,其中Toll樣受體3(TLR3)主要表達(dá)于樹突狀細(xì)胞,能夠識(shí)別病毒的dsRNA,在抗病毒過(guò)程中發(fā)揮了重要作用。TLR

3、4是最早發(fā)現(xiàn)的哺乳動(dòng)物TLRs蛋白,機(jī)體多種細(xì)胞表面均能表達(dá)TLR4,它被認(rèn)為與革蘭氏陰性細(xì)菌及其內(nèi)毒素的識(shí)別和激活有關(guān)。它們?cè)诟闻K疾病包括酒精性肝病、病毒性肝炎、肝纖維化等的發(fā)生、發(fā)展過(guò)程中發(fā)揮重要作用。
　　 在本研究中,我們通過(guò)轉(zhuǎn)染HCV NS5A蛋白表達(dá)質(zhì)粒觀察HCV NS5A蛋白對(duì)肝細(xì)胞內(nèi)TLR3及TLR4 mRNA和蛋白表達(dá)的影響,為丙型肝炎的發(fā)病機(jī)制積累實(shí)驗(yàn)依據(jù),并對(duì)丙型肝炎的治療提供理論依據(jù)。
　　 方法

4、：1.質(zhì)粒轉(zhuǎn)染:將QSG7701細(xì)胞種植于六孔板,待細(xì)胞融合60-70％時(shí),按照說(shuō)明書中的轉(zhuǎn)染程序,分別將pcNS5A和pRc/CMV質(zhì)粒轉(zhuǎn)染入細(xì)胞,12小時(shí)后換含10％胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基,轉(zhuǎn)染48小時(shí)后收集細(xì)胞進(jìn)行接下來(lái)的實(shí)驗(yàn)。
　　 2.免疫細(xì)胞化學(xué)染色:用免疫細(xì)胞化學(xué)染色的方法檢測(cè)TLR4蛋白質(zhì)及NSSA蛋白質(zhì)的表達(dá)。
　　 3.RT-PCR:按RNA提取試劑盒說(shuō)明書進(jìn)行,提取上述轉(zhuǎn)染的7701細(xì)胞總RNA,

5、用紫外光分光光度計(jì)測(cè)定RNA的濃度。取2ugRNA,逆轉(zhuǎn)錄為cDNA進(jìn)行PCR擴(kuò)增,再用2％瓊脂糖凝膠電泳觀測(cè)TLR3 mRNA及TLR4 mRNA結(jié)果并照相。
　　 4.間接免疫熒光:用間接免疫熒光的方法檢測(cè)TLR3及TLR4蛋白質(zhì)的表達(dá)。
　　 5.Western blot:用Western blot的方法以β-actin為參照,檢測(cè)TLR4蛋白質(zhì)的表達(dá)。
　　 結(jié)果：1.轉(zhuǎn)染pcNS5A質(zhì)粒組的7701細(xì)胞

6、內(nèi)有HCV NS5A蛋白顆粒表達(dá),呈棕黃色顆粒,主要分布在細(xì)胞漿中,以胞核周圍最為明顯,未轉(zhuǎn)染組和轉(zhuǎn)染pRc/CMV質(zhì)粒組的7701細(xì)胞中則無(wú)HCVNS5A蛋白表達(dá)。
　　 2.用免疫細(xì)胞化學(xué)染色檢測(cè)TLR4蛋白的表達(dá),結(jié)果顯示轉(zhuǎn)染pcNS5A質(zhì)粒組內(nèi)有TLR4蛋白質(zhì)表達(dá),呈棕黃色顆粒,分布在細(xì)胞膜中,未轉(zhuǎn)染組和轉(zhuǎn)染pRc/CMV質(zhì)粒組則無(wú)明顯TLR4蛋白表達(dá)。說(shuō)明HCVNS5A能夠促進(jìn)TLR4蛋白質(zhì)的表達(dá)。
　　 3.

7、用RT-PCR檢測(cè)TLR3及TLR4 mRNA的表達(dá)。結(jié)果表明,在GAPDH內(nèi)參照表達(dá)一致情況下,pcNS5A質(zhì)粒轉(zhuǎn)染組TLR4 mRNA的表達(dá)量明顯高于空載體組和未轉(zhuǎn)染組,空載體組和未轉(zhuǎn)染組mRNA的表達(dá)相似,結(jié)果說(shuō)明HCV NS5A能夠激活TLR4 mRNA的轉(zhuǎn)錄水平;然而,pcNS5A質(zhì)粒轉(zhuǎn)染組與空載體組和未轉(zhuǎn)染組TLR3 mRNA的表達(dá)量無(wú)明顯差別,說(shuō)明HCV NS5A對(duì)TLR3mRNA的轉(zhuǎn)錄水平至少無(wú)上調(diào)作用。
　　

8、4.用免疫熒光方法檢測(cè)TLR3及TLR4蛋白質(zhì)的表達(dá)。結(jié)果顯示轉(zhuǎn)染pcNS5A質(zhì)粒組內(nèi)有TLR4蛋白質(zhì)表達(dá),呈現(xiàn)綠色熒光顆粒,未轉(zhuǎn)染組和轉(zhuǎn)染pRc/CMV質(zhì)粒組則無(wú)明顯TLR4蛋白表達(dá)。說(shuō)明HCV NS5A能夠促進(jìn)TLR4蛋白質(zhì)的表達(dá)。轉(zhuǎn)染pcNS5A質(zhì)粒組內(nèi)及未轉(zhuǎn)染組和轉(zhuǎn)染pRc/CMV質(zhì)粒組的細(xì)胞內(nèi)均無(wú)TLR3蛋白顆粒的表達(dá),說(shuō)明HCV NS5A對(duì)TLR3蛋白的表達(dá)無(wú)上調(diào)作用。
　　 5.用Western blot檢測(cè)TUR

9、4蛋白質(zhì)的表達(dá),以β-actin為內(nèi)參照。結(jié)果顯示pcNS5A質(zhì)粒轉(zhuǎn)染組TLR4蛋白質(zhì)的表達(dá)量明顯高于空載體組和未轉(zhuǎn)染組,空載體組和未轉(zhuǎn)染組的表達(dá)相似。說(shuō)明HCV NS5A能夠促進(jìn)TLR4蛋白質(zhì)的表達(dá)。
　　 結(jié)論：1.HCV NS5A表達(dá)質(zhì)粒能夠轉(zhuǎn)染至QSG7701細(xì)胞中,表達(dá)HCV NS5A蛋白。
　　 2.HCV NS5A能激活TLR4 mRNA的轉(zhuǎn)錄水平。
　　 3.HCV NS5A能促進(jìn)TLR4蛋白質(zhì)的