TLR3 在喉癌中的表達(dá)及 siRNA 沉默 TLR3 基因表達(dá)誘導(dǎo)喉癌細(xì)胞凋亡機(jī)制的研究.pdf

1、研究背景：
　　喉癌是耳鼻咽喉科常見的惡性腫瘤之一，占頭頸腫瘤的30％～50%，近年發(fā)病有上升趨勢。美國癌癥協(xié)會根據(jù)近30年的數(shù)據(jù)指出喉癌是所有惡性腫瘤五年生存率唯一沒得到提高的腫瘤。隨著分子生物學(xué)的發(fā)展，喉癌的發(fā)生發(fā)展己被證實是多基因、多步驟漸進(jìn)發(fā)展的結(jié)果。尋找新的分子診斷標(biāo)記物和治療靶點，實現(xiàn)喉癌的個體化治療已成為當(dāng)前喉癌研究的重要方向之一。
　　Toll樣受體（Toll like receptors，TLRs）是一種模

2、式識別受體(pattern recognition receptor,PRRs),能識別來源于宿主的病原體相關(guān)分子模式（athogen-associated molecular patterns，PAMPs）。其中Toll樣受體3（Toll-like receptor3，TLR3）是TLRs家族中重要成員之一，是一類最重要的PRRs[1]，與其它TLRs信號轉(zhuǎn)導(dǎo)不同的是，TLR3不依賴轉(zhuǎn)接蛋白髓樣分化因子88（myeloid diffe

3、rentiation foctor88，MyD88），而是依賴TRIF（TIR-domain-containing molecule1，TICAM1）轉(zhuǎn)接蛋白，即所謂TRIF途徑。TLR3激活后，通過TRIF途徑介導(dǎo)了細(xì)胞的凋亡，其凋亡過程是通過過受體相互作用(receptor-inferact－ing protein,RIP)介導(dǎo)的caspase-3激活誘導(dǎo)的途徑。
　　眾多研究表明腫瘤的發(fā)生與凋亡受阻有關(guān)，誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡已成為腫

4、瘤治療的重要思路。在多發(fā)性骨髓瘤細(xì)胞，乳腺癌細(xì)胞，黑色素瘤細(xì)胞中TLR3均參與于細(xì)胞凋亡過程。迄今為止，國內(nèi)外針對喉癌中TLR3表達(dá)情況及其可能作用機(jī)制少見報道。本研究首先檢測TLR3在喉鱗癌組織表達(dá)與喉癌臨床特征相關(guān)情況；并利用小RNA干擾技術(shù)沉默TLR3在Hep-2細(xì)胞的表達(dá)進(jìn)一步研究siTLR3誘導(dǎo)Hep-2細(xì)胞凋亡可能機(jī)制和siTLR3對Hep-2抑制遷移及侵襲能力生物學(xué)行為的影響；以期明確TLR3基因在喉癌中的地位及可能的作用

5、機(jī)制，為喉癌的診治提供新的篩選基因。
　　本文旨在證實TLR3在喉鱗癌組織表達(dá)與喉癌臨床特征相關(guān)情況；并初步探討沉默TLR3基因后誘導(dǎo)喉癌hep-2細(xì)胞凋亡的可能調(diào)控機(jī)制。
　　方法：
　?。?）用免疫組化法檢測TLR3蛋白在53例喉鱗癌組織和30例癌旁正常(對照組)組織中的表達(dá)，分析其與臨床病理學(xué)特征的關(guān)系
　?。?）設(shè)計并合成針對TLR3的小干擾RNA（small interference RNA，siRNA

6、）3條序列及與TLR3無基因同源性的陰性對照（NC，negative control），在lipofectamine3000介導(dǎo)下轉(zhuǎn)染Hep-2細(xì)胞，應(yīng)用PCR及Western blot驗證轉(zhuǎn)染效率；
　?。?）采用細(xì)胞劃痕實驗和transwell侵襲實驗檢測沉默TLR3對Hep-2細(xì)胞遷移和侵襲能力的影響。
　?。?）通過細(xì)胞TUNEL檢測法和流式細(xì)胞技術(shù)分別檢測沉默TLR3后Hep-2細(xì)胞活力和細(xì)胞周期、細(xì)胞凋亡的變化。

7、
　　(5)采用Western blot檢測沉默TLR3表達(dá)后caspase/bcl-2家族蛋白水平的表達(dá)。
　　結(jié)論：
　　（1）TLR3在喉癌腫瘤組織中的表達(dá)和68%（36/53）明顯高于癌旁組織中的表達(dá)11%(6/53)，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.01)。TLR3的表達(dá)水平與患者年齡、性別及吸煙史無明顯相關(guān)性，但與腫瘤T分期及淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移N分期顯著相關(guān)，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.01）。
　?。?）TLR

8、3siRNA-3組的TLR3表達(dá)最低（P＜0.05）。
　?。?）細(xì)胞劃痕實驗和Transwell侵襲實驗顯示，siTLR3組細(xì)胞遷移和侵襲細(xì)胞數(shù)明顯低于NC組(P＜0.05)。
　?。?）與NC組相比，siTLR3組細(xì)胞的細(xì)胞周期被阻滯在G2/M期(P＜0.05)， S期細(xì)胞明顯減少(P＜0.05)。與NC組比，siTLR3實驗組細(xì)胞凋亡率為較NC組的增加(P＜0.05)。siTLR3組的72小時細(xì)胞活力明顯低于NC組(P

9、＜0.05)
　?。?）細(xì)胞TUNEL實驗:siTLR3實驗組每視野性中TUNEL檢測陽性的細(xì)胞占20.1％, NC（陰性對照組）每視野性中TUNEL檢測陽性的細(xì)胞占5％。兩者相比具有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）
　　(6)Western blot結(jié)果顯示，沉默TLR3基因后細(xì)胞cleaved-Caspase3、cleaved-Caspase8和cleaved-Caspase9均有不同程度的升高,抗凋亡蛋白Bcl-2的表達(dá)水平