TLR3在HSV-1感染小鼠NSCs中的作用研究.pdf

1、目的:
　　 1.探討TLR3在HSV-1感染小鼠NSCs中的作用，研究HSV-1通過(guò)TLR3對(duì)NF-κB轉(zhuǎn)錄活性及細(xì)胞因子TNF-α和IL-10表達(dá)的影響。
　　 2.研究TLR3在HSV-1感染小鼠NSCs中對(duì)IRF3磷酸化及IFN-β表達(dá)的影響。
　　 材料和方法:
　　 1.體外分離并用含mEGF、mbFGF和B27的NSCs生長(zhǎng)培養(yǎng)基培養(yǎng)小鼠胚胎皮層NSCs，通過(guò)免疫熒光方法檢測(cè)NSCs標(biāo)志物的

2、表達(dá)并對(duì)NSCs分化能力進(jìn)行鑒定。
　　 2.HSV-1感染原代培養(yǎng)的第3代NSCs，通過(guò)免疫熒光、RT-PCR、Western blot、ELISA等方法分別檢測(cè)TLR3、NF-κB、TNF-α、IL-10 mRNA和蛋白的表達(dá)，同時(shí)研究NF-κB通路抑制劑PDTC及TLR3中和抗體對(duì)NF-κB通路的影響。
　　 3.HSV-1感染原代培養(yǎng)的第3代NSCs，并構(gòu)建沉默TLR3的慢病毒載體感染NSCs，抑制TLR3的表達(dá)

3、，通過(guò)免疫熒光、RT-PCR、Western blot、ELISA等方法研究NSCs中TLR3和IRF3及IFN-β的表達(dá)特點(diǎn)。
　　 結(jié)果:
　　 1.正常狀態(tài)下，NSCs表達(dá)TLR3和NF-κB;被HSV-1感染的NSCs，核內(nèi)NF-κB蛋白表達(dá)明顯增強(qiáng)，同時(shí)炎性細(xì)胞因子TNF-α、IL-10在mRNA和蛋白水平的表達(dá)均上調(diào)。PDTC可抑制NF-κB活化，使核內(nèi)NF-κB蛋白表達(dá)下調(diào)，導(dǎo)致細(xì)胞內(nèi)TNF-α、IL-10

4、 mRNA和蛋白的表達(dá)下調(diào)。用TLR3中和抗體阻斷NSCs表面TLR3后，核內(nèi)NF-κB蛋白表達(dá)下調(diào)，TNF-α、IL-10 mRNA和蛋白也明顯下調(diào)，NSCs通過(guò)天然免疫抗病毒作用減弱，表現(xiàn)為HSV-1 gD mRNA在細(xì)胞內(nèi)表達(dá)明顯增強(qiáng)，病毒滴度增高。
　　 2.NSCs被HSV-1感染后， IRF3 mRNA表達(dá)上調(diào)，其蛋白磷酸化也明顯增強(qiáng)，同時(shí)IFN-β mRNA和蛋白的表達(dá)也相應(yīng)上調(diào)。用慢病毒抑制TLR3表達(dá)后，IRF

5、3mRNA及其蛋白磷酸化明顯下調(diào)，同時(shí)IFN-β mRNA和蛋白的表達(dá)也相應(yīng)下調(diào)，并且HSV-1在細(xì)胞內(nèi)復(fù)制增加，病毒滴度增高。
　　 結(jié)論:
　　 1.NSCs是HSV-1的完全容許細(xì)胞。正常NSCs表達(dá)TLR3、NF-κB;被HSV-1感染的NSCs通過(guò)TLR3活化NF-κB，從而上調(diào)炎性細(xì)胞因子TNF-α、IL-10的表達(dá)，發(fā)揮天然免疫抗病毒作用。
　　 2.HSV-1感染NSCs后，TLR3表達(dá)上調(diào)，促進(jìn)