Tlr3在小鼠感光細(xì)胞中的作用研究.pdf

1、目的：已有研究表明，固有免疫炎癥反應(yīng)在干性年齡相關(guān)性黃斑變性（干性AMD）中起到十分重要的作用。但是，這些研究目前為止主要集中在視網(wǎng)膜色素上皮細(xì)胞（RPE）上。隨著干性AMD的病程進(jìn)展，RPE和感光細(xì)胞會(huì)發(fā)生變性，并且在RPE層和Bruch膜內(nèi)膠原層之間也會(huì)出現(xiàn)玻璃膜疣的蓄積。研究證實(shí)，在RPE中， Toll樣受體3（Tlr3）能夠被玻璃膜疣的成分激活并介導(dǎo)免疫炎癥反應(yīng)。我們前期的研究表明，Tlr3在小鼠視網(wǎng)膜感光細(xì)胞中高度表達(dá)。雖然感

2、光細(xì)胞和RPE均在AMD中發(fā)生變性，但Tlr3在感光細(xì)胞的作用卻并不清楚。因此，本研究旨在以往研究的基礎(chǔ)上，探究Tlr3在感光細(xì)胞中的作用。
　　方法：1.我們首先利用免疫熒光染色和半定量PCR分析去檢測(cè)Tlr3在小鼠視網(wǎng)膜和小鼠感光細(xì)胞系661W細(xì)胞中的表達(dá)情況。
　　2.我們?cè)?月齡的C57BL/6J小鼠視網(wǎng)膜下腔注射Tlr3的配體Poly I:C，建立免疫激活動(dòng)物模型。利用眼底照相和OCT（光學(xué)相關(guān)斷層成像術(shù)）技術(shù)來觀

3、察小鼠視網(wǎng)膜結(jié)構(gòu)的變化情況。采用全視野ERG（視網(wǎng)膜電圖）和Focal ERG來進(jìn)一步檢測(cè)小鼠視網(wǎng)膜功能是否受影響。然后我們用TUNEL染色技術(shù)、線粒體膜電位檢測(cè)和Annexin-V/PI雙染實(shí)驗(yàn)來明確Tlr3配體引起的細(xì)胞凋亡情況，此外，免疫熒光染色被用來檢測(cè)視網(wǎng)膜免疫細(xì)胞活化情況。
　　3.我們將Poly I:C處理組作為實(shí)驗(yàn)組，將Poly dI:dC處理組和PBS處理組作為對(duì)照組，分別去刺激小鼠感光細(xì)胞661W細(xì)胞，然后進(jìn)行

4、RNAseq，并將實(shí)驗(yàn)組和對(duì)照組的測(cè)序結(jié)果進(jìn)行比對(duì)。我們篩選出部分表達(dá)上調(diào)的編碼炎癥因子的基因作為候選基因，再利用RT-PCR去檢測(cè)這些候選基因的表達(dá)情況。
　　結(jié)果：1.免疫染色結(jié)果顯示Tlr3主要表達(dá)在小鼠視網(wǎng)膜神經(jīng)節(jié)細(xì)胞、RPE以及感光細(xì)胞，在感光細(xì)胞中主要位于內(nèi)節(jié)部位。半定量PCR檢測(cè)了Tlr家族成員Tlr1-Tlr9在661W細(xì)胞中的表達(dá)情況，結(jié)果顯示在661W細(xì)胞中共有4種Tlrs有表達(dá)，包括Tlr2，Tlr3，Tlr

5、4和Tlr5，其中Tlr3的表達(dá)量最高。進(jìn)一步利用661W細(xì)胞進(jìn)行免疫印跡實(shí)驗(yàn)同樣檢測(cè)到Tlr3的表達(dá)。
　　2.視網(wǎng)膜結(jié)構(gòu)：眼底照相顯示小鼠視網(wǎng)膜注射區(qū)域的RPE嚴(yán)重?fù)p害，OCT結(jié)果也同樣顯示了不僅僅是RPE層，連同感光細(xì)胞層在Poly I:C處理后也嚴(yán)重受損。視網(wǎng)膜功能：全視野ERG結(jié)果顯示暗適應(yīng)ERG和混合反應(yīng)ERG的波幅明顯下降，而Focal ERG結(jié)果顯示波幅明顯下降，表明在注射區(qū)域以及注射區(qū)域以外視網(wǎng)膜功能受到明顯損害

6、。感光細(xì)胞凋亡情況：經(jīng)Poly I:C刺激的661W細(xì)胞和小鼠視網(wǎng)膜感光細(xì)胞均發(fā)生明顯凋亡。免疫炎癥反應(yīng)：小鼠接受Poly I:C注射后，其視網(wǎng)膜免疫細(xì)胞如Müller細(xì)胞和小膠質(zhì)細(xì)胞發(fā)生激活；而Poly I:C刺激培養(yǎng)的661W細(xì)胞后，多種細(xì)胞炎癥因子表達(dá)水平明顯升高。此外，Poly I:C刺激離體培養(yǎng)的神經(jīng)視網(wǎng)膜后也同樣引起細(xì)胞炎癥因子表達(dá)上升。
　　3. RNAseq結(jié)果顯示，和Poly dI:dC對(duì)照組相比，Poly I:

7、C轉(zhuǎn)染細(xì)胞后更多的基因表達(dá)發(fā)生改變，其中 Tlr3和一些細(xì)胞炎癥因子如Cxcl10、Ccl5和Il33的表達(dá)也明顯上調(diào)。
　　結(jié)論：我們利用Tlr3的配體Poly I:C分別去刺激C57BL/6J小鼠視網(wǎng)膜、鼠源的感光細(xì)胞系661W細(xì)胞以及離體培養(yǎng)的小鼠神經(jīng)視網(wǎng)膜，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，感光細(xì)胞能夠作為Poly I:C刺激的直接作用靶點(diǎn)。此外，Tlr3作為Poly I:C刺激的主要感受器，能夠進(jìn)一步觸發(fā)細(xì)胞的炎癥反應(yīng)，最終導(dǎo)致感光細(xì)胞發(fā)生凋亡