3T3-L1細(xì)胞TLR4的表達(dá)對(duì)AKT信號(hào)通路的影響.pdf

1、目的：toll樣受體4（toll-like receptor4，TLR4）在機(jī)體天然免疫系統(tǒng)識(shí)別病原體過程中發(fā)揮著非常重要的作用。近年來炎癥在糖尿病中的作用受到重視，而AKT信號(hào)通路之一就是胰島素信號(hào)通路。本實(shí)驗(yàn)旨在研究，在脂肪細(xì)胞中激活TLR4后，對(duì)于脂肪細(xì)胞中AKT信號(hào)通路有無影響；并且探討天津地區(qū)人群中TLR4基因Asp299Gly、Thr399Ile多態(tài)性以及過氧化物酶體增殖物激活受體γ（peroxisome prolifera

2、tor-activated receptorγ，PPARγ）基因Pro12Ala多態(tài)性與2型糖尿?。╰ype2 diabetes mellitus，T2DM）的關(guān)系。 方法： 1．用DMEM培養(yǎng)基培養(yǎng)3T3-L1細(xì)胞，待其接觸抑制以后，加入誘導(dǎo)劑使其分化為脂肪細(xì)胞。 2．利用油紅染色的方法對(duì)脂肪細(xì)胞進(jìn)行鑒定。 3．在脂肪細(xì)胞中加入脂多糖（lipopolysaccharides，LPS），作用1 h后，提取

3、細(xì)胞總RNA，采用realtime-PCR的方法測定TLR4的mRNA表達(dá)豐度。 4．提取細(xì)胞總蛋白，western blot的方法檢測p-AKT蛋白表達(dá)水平。 5．分別提取365名2型糖尿病人和95名健康人的基因組DNA，PCR擴(kuò)增目的基因片斷。 6．用變性高效液相色譜（denaturing high performance liquid chromatography，DHPLC）篩查TLR4基因Asp299G

4、ly、Thr399Ile位點(diǎn)以及PPARγ基因Pro12Ala位點(diǎn)多態(tài)性。 結(jié)果： 1．誘導(dǎo)3T3-L1細(xì)胞，誘導(dǎo)分化率比較高。誘導(dǎo)7-8天，90%以上的細(xì)胞分化成為脂肪細(xì)胞。 2．油紅染色結(jié)果呈陽性，大部分脂肪細(xì)胞染成紅色，胞漿中見大量脂滴。 3．脂肪細(xì)胞在用LPS作用1h后，TLR4的mRNA的表達(dá)明顯增加（P<0．05）。 4．在脂肪細(xì)胞中加入LPS后，p-AKT蛋白表達(dá)水平下降（P<0．0

5、5）。 5．在T2DM組和對(duì)照組均未篩查到TLR4基因Asp299Gly、Thr399Ile突變基因型的存在。 6．T2DM組和健康人對(duì)照組PPARγ基因Pro12Ala位點(diǎn)P/A的基因型頻率分別為0．074和0．032（27/365和3/95），兩組相比差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0．05）。 結(jié)論： 1．誘導(dǎo)3T3-L1細(xì)胞分化成脂肪細(xì)胞，具有較高的分化率，可達(dá)90%以上。 2．脂肪細(xì)胞中加入LPS

6、后，TLR4的mRNA的表達(dá)豐度增加，而p-AKT水平下降，初步說明TLR4的表達(dá)可以抑制脂肪細(xì)胞中AKT信號(hào)通路。 3．天津地區(qū)人群未篩查到TLR4基因Asp299Gly、Thr399Ile突變基因型，其多態(tài)性與T2DM無明顯關(guān)聯(lián)。 4．天津地區(qū)人群PPARγ基因Pro12Ala多態(tài)性與T2DM無明顯關(guān)聯(lián)。 5．DHPLC是一種快速有效的基因突變篩查方法，可以用來篩查2型糖尿病易感基因，預(yù)測糖尿病發(fā)病的易感性。