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文檔簡介
1、目的:toll樣受體4(toll-like receptor4,TLR4)在機(jī)體天然免疫系統(tǒng)識(shí)別病原體過程中發(fā)揮著非常重要的作用。近年來炎癥在糖尿病中的作用受到重視,而AKT信號(hào)通路之一就是胰島素信號(hào)通路。本實(shí)驗(yàn)旨在研究,在脂肪細(xì)胞中激活TLR4后,對(duì)于脂肪細(xì)胞中AKT信號(hào)通路有無影響;并且探討天津地區(qū)人群中TLR4基因Asp299Gly、Thr399Ile多態(tài)性以及過氧化物酶體增殖物激活受體γ(peroxisome prolifera
2、tor-activated receptorγ,PPARγ)基因Pro12Ala多態(tài)性與2型糖尿?。╰ype2 diabetes mellitus,T2DM)的關(guān)系。 方法: 1.用DMEM培養(yǎng)基培養(yǎng)3T3-L1細(xì)胞,待其接觸抑制以后,加入誘導(dǎo)劑使其分化為脂肪細(xì)胞。 2.利用油紅染色的方法對(duì)脂肪細(xì)胞進(jìn)行鑒定。 3.在脂肪細(xì)胞中加入脂多糖(lipopolysaccharides,LPS),作用1 h后,提取
3、細(xì)胞總RNA,采用realtime-PCR的方法測定TLR4的mRNA表達(dá)豐度。 4.提取細(xì)胞總蛋白,western blot的方法檢測p-AKT蛋白表達(dá)水平。 5.分別提取365名2型糖尿病人和95名健康人的基因組DNA,PCR擴(kuò)增目的基因片斷。 6.用變性高效液相色譜(denaturing high performance liquid chromatography,DHPLC)篩查TLR4基因Asp299G
4、ly、Thr399Ile位點(diǎn)以及PPARγ基因Pro12Ala位點(diǎn)多態(tài)性。 結(jié)果: 1.誘導(dǎo)3T3-L1細(xì)胞,誘導(dǎo)分化率比較高。誘導(dǎo)7-8天,90%以上的細(xì)胞分化成為脂肪細(xì)胞。 2.油紅染色結(jié)果呈陽性,大部分脂肪細(xì)胞染成紅色,胞漿中見大量脂滴。 3.脂肪細(xì)胞在用LPS作用1h后,TLR4的mRNA的表達(dá)明顯增加(P<0.05)。 4.在脂肪細(xì)胞中加入LPS后,p-AKT蛋白表達(dá)水平下降(P<0.0
5、5)。 5.在T2DM組和對(duì)照組均未篩查到TLR4基因Asp299Gly、Thr399Ile突變基因型的存在。 6.T2DM組和健康人對(duì)照組PPARγ基因Pro12Ala位點(diǎn)P/A的基因型頻率分別為0.074和0.032(27/365和3/95),兩組相比差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。 結(jié)論: 1.誘導(dǎo)3T3-L1細(xì)胞分化成脂肪細(xì)胞,具有較高的分化率,可達(dá)90%以上。 2.脂肪細(xì)胞中加入LPS
6、后,TLR4的mRNA的表達(dá)豐度增加,而p-AKT水平下降,初步說明TLR4的表達(dá)可以抑制脂肪細(xì)胞中AKT信號(hào)通路。 3.天津地區(qū)人群未篩查到TLR4基因Asp299Gly、Thr399Ile突變基因型,其多態(tài)性與T2DM無明顯關(guān)聯(lián)。 4.天津地區(qū)人群PPARγ基因Pro12Ala多態(tài)性與T2DM無明顯關(guān)聯(lián)。 5.DHPLC是一種快速有效的基因突變篩查方法,可以用來篩查2型糖尿病易感基因,預(yù)測糖尿病發(fā)病的易感性。
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