南方水稻黑條矮縮病毒P10與介體白背飛虱互作蛋白的分析和鑒定.pdf

1、南方水稻黑條矮縮病毒(Southern rice black-streaked dwarf virus,SRBSDV)最早于2001年在中國廣東省陽江市發(fā)現(xiàn)。SRBSDV是呼腸孤病毒科（Reoviridae）斐濟(jì)病毒屬（Fijivirus）的成員，其引起的南方水稻黑條矮縮病可導(dǎo)致水稻生產(chǎn)的嚴(yán)重減產(chǎn)。該病毒通過白背飛虱(WBPH, Sogatella furcifera Horvath, Hemiptera: Delphacidae)以持

2、久增殖型方式進(jìn)行傳播。在過去的幾年內(nèi)，借助白背飛虱的遷移，SRBSDV已經(jīng)迅速蔓延至中國南部、越南北部、日本和泰國，成為亞洲東南部和東部最重要的水稻病毒病之一。白背飛虱可借助風(fēng)力進(jìn)行長距離遷移，因此其在亞洲大部分國家均有分布，包括中國、巴基斯坦、日本、韓國、沙特阿拉伯、泰國、印度、印度尼西亞、斐濟(jì)、孟加拉國和塞舌爾。帶毒白背飛虱的遷移分散可導(dǎo)致SRBSDV的二次侵染，進(jìn)而造成南方水稻黑條矮縮病的爆發(fā)。
　　病毒通過與介體昆蟲之間的

3、特異性互作來完成其有效的傳播，這種互作可以幫助病毒在昆蟲體內(nèi)各個組織間運輸，并能克服昆蟲各種免疫反應(yīng)。目前針對病毒在介體內(nèi)侵染、移動和復(fù)制過程的分子機理和涉及的互作蛋白的研究較少，因此，為解析介體昆蟲的傳毒機制則必須明確和鑒定與病毒互作的介體昆蟲蛋白。在本研究中，我們利用了酵母雙雜交技術(shù)，以 SRBSDV的外殼蛋白P10為誘餌，篩選了介體白背飛虱的cDNA文庫，共獲得了130個互作的白背飛虱蛋白。根據(jù)基因注釋（GO）對這130種互作蛋白

4、進(jìn)行了分類，其中依據(jù)分子功能可分為12類，依據(jù)生物學(xué)過程可分為9類，依據(jù)細(xì)胞組分可分為8類。同時對這些互作蛋白的的最佳匹配物種進(jìn)行了分析，其中12.3％的蛋白與內(nèi)華達(dá)古白蟻（Zootermopsis nevadensis）同源，9.2%與赤擬谷盜(Tribolium castanetum)同源，4.6%可比對上白背飛虱已知序列，4.6%與致倦庫蚊（Culex quinquefasciatu）同源，3.5%分別與柑橘木虱（Diaphori

5、na citri）、黑腹果蠅（Drosophila melanogaster）、歐洲熊蜂（Bombus terrestris）和苜蓿切葉蜂（Megachile rotundata）同源。
　　根據(jù)互作蛋白的分子功能、參與的生物過程以及blast的比對結(jié)果，選出28種候選蛋白進(jìn)行了酵母雙雜交再次共轉(zhuǎn)驗證，β-半乳糖苷酶實驗顯示25種蛋白與SRBSDV-P10存在互作，其中15種蛋白存在顯著互作。隨后對這15種蛋白的編碼序列進(jìn)行擴(kuò)增，

6、利用5’RACE試劑盒以酵母雙雜篩選到的序列為基礎(chǔ)獲得了5種蛋白的全長ORF，分別為囊泡相關(guān)膜蛋白7(VAMP7)、囊泡運輸?shù)鞍祝╒tila）、生長激素誘導(dǎo)的跨膜蛋白（Ghitm）、初生多肽相關(guān)復(fù)合體 alpha亞基和ATP合成酶脂質(zhì)結(jié)合蛋白（線粒體）。進(jìn)一步利用pull-down技術(shù)對這5種蛋白與SRBSDV-P10的互作進(jìn)行了驗證，結(jié)果顯示其中3種蛋白（VAMP7、Vtila和Ghitm）與 SRBSDV-P10存在互作。
　

7、　我們進(jìn)一步通過RT-qPCR對pull-down驗證的互作蛋白VAMP7，Vti1a和Ghitm進(jìn)行了轉(zhuǎn)錄水平分析。結(jié)果顯示VAMP7和 Ghitm在雄性成蟲中表達(dá)量高，Vti1a在雌性成蟲階段含量豐富。比較分析VAMP7，Vti1a和 Ghitm在白背飛虱6種不同組織(血淋巴、唾液腺、腸、馬氏管、脂肪體和卵巢)轉(zhuǎn)錄水平，結(jié)果顯示VAMP7主要在腸內(nèi)轉(zhuǎn)錄，Vti1a和Ghitm在馬氏管內(nèi)轉(zhuǎn)錄水平最高。在不同發(fā)育階段和不同組織轉(zhuǎn)錄水平的