侵染玉米的水稻黑條矮縮病毒遺傳變異及其致病途徑解析.pdf

1、玉米粗縮病(Maize rough dwarf disease，MRDD)是世界性的玉米病毒病害之一，在我國(guó)黃淮海夏玉米區(qū)發(fā)生尤為嚴(yán)重，主要病原為水稻黑條矮縮病毒(Rice black-streaked dwarf virus，RBSDV)，由灰飛虱（Laodelphax striatellus，SBPH）介導(dǎo)以持久性傳播。解析我國(guó)玉米粗縮病病原RBSDV遺傳變異，及其在玉米中的致病途徑是玉米粗縮病抗性機(jī)理研究和抗病育種的重要內(nèi)容。本文

2、采集我國(guó)玉米粗縮病高發(fā)區(qū)的玉米和水稻病株，通過(guò)病毒基因組測(cè)序，分析了病毒的遺傳變異與進(jìn)化;通過(guò)研究RBSDV侵染后玉米轉(zhuǎn)錄組、miRNA-靶基因的差異，解析可能的致病途徑，為玉米粗縮病抗性機(jī)理研究和抗病育種提供基礎(chǔ)。具體研究結(jié)果如下:
　　1.分析來(lái)自2012-2014年9個(gè)地點(diǎn)玉米和水稻病株的RBSDV基因組區(qū)段S1-S10遺傳變異。(1)僅基因組區(qū)段S8存在9bp的缺失，其它區(qū)段均無(wú)插入或缺失突變;兩個(gè)堿基間突變占變異總數(shù)的9

3、3.73％-96.11％，轉(zhuǎn)換(transition，76.87％-85.92％)大于顛換(transversion，8.69％-17.43％)，其中嘧啶(U/C)間轉(zhuǎn)換最多，占47.72％-59.60％;核苷酸多樣性最高的S9（π=0.0626）極顯著（P＜0.01）高于最低的S4（π=0.0225）;來(lái)自山東濟(jì)南點(diǎn)的RBSDV基因組區(qū)段S9(π=0.0755)和S7(π=0.0391)核苷酸多樣性最高，而江蘇省南京和鹽城的S9(π=

4、0.0391)和S7(π=0.0090)區(qū)段核苷酸多樣性最低，差異達(dá)到極顯著水平(P＜0.01);玉米和水稻寄主間RBSDV基因組區(qū)段核苷酸多樣性差異不顯著(P＞0.05);2013年分離株S7序列核苷酸多樣性（π=0.0307）顯著高于2014年(π=0.0244)(P=0.0226)。(2)在S9和S7中分別檢測(cè)到3個(gè)和1個(gè)重組事件，重組事件發(fā)生在不同寄主和地點(diǎn)間。采用46個(gè)非重組的RBSDV分離物S9序列與23個(gè)GenBank數(shù)據(jù)

5、庫(kù)中的S9序列構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹。基于S9系統(tǒng)發(fā)育分析表明中國(guó)玉米粗縮病株的病毒分離物遺傳距離與RBSDV較近，與其它病毒(例如MRDV、MRCV或SRBSDV)遺傳距離較遠(yuǎn);基于S9和S7序列多樣性均將RBSDV劃分為兩個(gè)類群，S7群進(jìn)一步劃分為兩個(gè)亞群，分群與寄主和年份無(wú)關(guān)。(3)在氨基酸水平，P5-2變異最大（平均每10個(gè)氨基酸存在一個(gè)變異），P2變異最小（平均每45個(gè)氨基酸存在一個(gè)變異），同一基因組區(qū)段不同閱讀框(ORF)編碼蛋白的

6、氨基酸變異不一致。(4)預(yù)測(cè)RBSDV S1-S10基因組區(qū)段的保守區(qū)，針對(duì)每個(gè)序列的保守區(qū)域設(shè)計(jì)并構(gòu)建了針對(duì)不同靶位的RNAi載體。
　　2.采用49個(gè)S9序列和111個(gè)S7序列分析RBSDV的選擇響應(yīng)。S7（含有兩個(gè)ORF，分別表示為S7-1和S7-2）序列A+U含量豐富，且密碼子多以A-(A3s，S7-1:32.64％, S7-2:29.95％)或U-結(jié)尾(U3s，S7-1:44.18％，S7-2:46.06％);S7密碼子

7、偏性程度低(Nc, S7-1:45.63; S7-2:39.96)，突變是RBSDV-S7密碼子偏性的主要原因，且密碼子偏性與年份、寄主及地點(diǎn)無(wú)關(guān);在S7-1和S7-2中共檢測(cè)到12個(gè)最優(yōu)密碼子。S9(含有兩個(gè)ORF，分別表示為S9-1和S9-2)與S7的ORF均承受負(fù)向選擇或純化作用(Ka/Ks ratios:0.0179-0.0589);同一基因組區(qū)段不同ORF選擇壓力水平不同，S9-2承受的選擇壓力顯著高于S9-1(P＜0.01)

8、，S7-1承受的選擇壓力顯著高于S7-2(P＜0.01);同一ORF在年份間、寄主間和地點(diǎn)間承受的選擇壓力差異不顯著。RBSDV群體呈顯著擴(kuò)增趨勢(shì)，在寄主、年份和部分地點(diǎn)間存在頻繁的遺傳交流。
　　3.采用組織超薄切片方法觀察玉米受RBSDV侵染后細(xì)胞組織形態(tài)變化，發(fā)現(xiàn)病毒主要存在于細(xì)胞質(zhì)和葉綠體中，病毒侵染后玉米韌皮部、細(xì)胞壁、葉綠體等均有明顯變化。利用RNA-seq技術(shù)對(duì)RBSDV侵染后的玉米轉(zhuǎn)錄組進(jìn)行測(cè)序，顯示發(fā)病相關(guān)、細(xì)胞

9、壁相關(guān)、赤霉素相關(guān)、韌皮部相關(guān)、葉綠素相關(guān)和泛素相關(guān)基因表達(dá)量均存在顯著差異。鑒定出17個(gè)玉米miRNA家族中31個(gè)響應(yīng)RBSDV的miRNA成員，表達(dá)量差異均在2倍以上，其中17個(gè)呈上調(diào)表達(dá)，14個(gè)呈下調(diào)表達(dá)。采用降解組測(cè)序方法鑒定靶基因，發(fā)現(xiàn)靶基因主要富集的細(xì)胞組件是細(xì)胞核和核糖體，主要功能是與轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)、DNA模板和DNA結(jié)合有關(guān)，其次與金屬離子結(jié)合、水解酶活性、酸酐和磷等以及壓力響應(yīng)和光合作用有關(guān);靶基因多參與光合作用等新陳代謝途