水稻缺刻蛋白在水稻齒葉矮縮病毒侵染模式下的表達(dá).pdf

1、水稻齒葉矮縮病是由褐飛虱（Nilaparvata Lugens）傳播的病毒病，其病原是水稻鋸齒葉矮縮病毒（Rice ragged stunt virus,RRSV），最明顯的癥狀表現(xiàn)為葉片卷縮、葉緣鋸齒。有研究發(fā)現(xiàn)缺刻蛋白（serrate protein,SE protein）基因在調(diào)節(jié)植物葉片的發(fā)育中起著重要的作用，并且本實(shí)驗(yàn)室通過RT-PCR檢測(cè)RRSV侵染后水稻體內(nèi)缺刻蛋白基因的表達(dá)量，發(fā)現(xiàn)RRSV侵染后水稻中缺刻蛋白SE-1基因

2、的表達(dá)量是明顯上調(diào)，而SE-2、SE-3基因的表達(dá)量與健康水稻相比差異不明顯。
　　為了研究水稻中SE啟動(dòng)子的功能，本實(shí)驗(yàn)構(gòu)建了SE啟動(dòng)子的植物表達(dá)載體。分別命名為Pro-SE-1、Pro-SE-2、Pro-SE-3。通過農(nóng)桿菌介導(dǎo)的遺傳轉(zhuǎn)化法和FloralDip法分別將其轉(zhuǎn)入日本晴水稻和擬南芥中，PCR檢測(cè)結(jié)果表明所有T0代轉(zhuǎn)基因水稻中共有75株抗性植株，其中Pro-SE-1T0代抗性植株27株，Pro-SE-2T0代抗性植株4

3、3株，Pro-SE-3T0代抗性植株5株。通過抗性篩選獲得了擬南芥T1代抗性植株。
　　利用GUS組織化學(xué)染色法對(duì)抗性植株進(jìn)行組織定位分析，結(jié)果顯示GUS基因在轉(zhuǎn)基因水稻的葉片中都有表達(dá)，Pro-SE-1轉(zhuǎn)基因水稻中GUS基因的表達(dá)在葉片中表達(dá)較弱，根和莖中沒有檢測(cè)到GUS基因的表達(dá)，而轉(zhuǎn)Pro-SE-2、Pro-SE-3基因的水稻中根、葉中有表達(dá)而且在根毛區(qū)表達(dá)強(qiáng)烈，葉緣處表達(dá)較明顯。通過GUS基因的表達(dá)量分析結(jié)果顯示，與對(duì)照相

4、比GUS基因在轉(zhuǎn)基因水稻中都有不同程度的表達(dá)。而Pro-SE-1啟動(dòng)子驅(qū)動(dòng)的GUS基因的表達(dá)量與轉(zhuǎn)Pro-SE-2啟動(dòng)子基因水稻中SE-1缺刻蛋白基因的表達(dá)量幾乎呈正相關(guān)性。在擬南芥中，GUS在轉(zhuǎn)基因擬南芥植株中不同部位均有表達(dá)，在花藥、幼葉中表達(dá)強(qiáng)烈，莖中沒有檢測(cè)到GUS基因的表達(dá)。
　　分析轉(zhuǎn)基因水稻表型發(fā)現(xiàn)轉(zhuǎn)Pro-SE-2基因的水稻植株表型表現(xiàn)出卷葉、缺刻的癥狀，轉(zhuǎn)Pro-SE-3基因的水稻葉片皺縮，Pro-SE-1轉(zhuǎn)基因

5、水稻未發(fā)現(xiàn)表型特異。通過實(shí)時(shí)熒光定量PCR技術(shù)分別對(duì)Pro-SE-1、Pro-SE-2、Pro-SE-3轉(zhuǎn)基因水稻中三個(gè)缺刻蛋白SE-1、SE-2、SE-3基因的表達(dá)量進(jìn)行了分析，結(jié)果表明：轉(zhuǎn)Pro-SE-1基因水稻中三個(gè)缺刻蛋白SE-1、SE-2、SE-3基因的表達(dá)量總體呈下調(diào)趨勢(shì)，而轉(zhuǎn)Pro-SE-2基因的水稻中SE-1基因表達(dá)量上調(diào)且有顯著性差異，SE-2、SE-3基因的表達(dá)量無明顯差異，轉(zhuǎn)Pro-SE-3基因的水稻中SE-1的基

6、因表達(dá)量下調(diào)，SE-2、SE-3的基因表達(dá)量上調(diào)但不顯著。
　　為了進(jìn)一步研究轉(zhuǎn)基因水稻中啟動(dòng)子與缺刻蛋白基因間的表達(dá)量關(guān)系，本實(shí)驗(yàn)制備了三個(gè)缺刻蛋白的多克隆抗體，并經(jīng)過ELISA檢測(cè)和western blot檢測(cè)，發(fā)現(xiàn)三個(gè)缺刻蛋白的抗體效價(jià)都很好，可以用作水稻缺刻蛋白表達(dá)量的檢測(cè)。
　　綜上所述，Pro-SE-2啟動(dòng)子基因可能促進(jìn)了水稻中內(nèi)源基因SE-1的高表達(dá)，Pro-SE-3啟動(dòng)子可能驅(qū)動(dòng)了其自身缺刻蛋白基因的高表達(dá)。