RNA干擾調(diào)控水稻齒矮病毒在介體褐飛虱培養(yǎng)細胞內(nèi)的持久侵染.pdf

1、水稻齒葉矮縮病毒（Rice ragged stunt virus, RRSV）是呼腸孤病毒科（Reoviridae）刺突呼腸孤亞科（Spinareovirinae）水稻病毒屬（Oryzavirus）的代表成員，由介體褐飛虱（Nilaparvata lugens）以持久增殖型方式傳播，但不經(jīng)卵傳。
　　前期研究利用褐飛虱培養(yǎng)細胞闡釋了非結(jié)構(gòu)蛋白Pns6和Pns10參與了病毒的復(fù)制，揭示了非結(jié)構(gòu)蛋白Pns7在病毒擴散過程中發(fā)揮的作用，

2、也明確了RRSV在褐飛虱體內(nèi)的侵染循回途徑。而在這些過程中，RRSV不僅需要突破昆蟲體內(nèi)的各種組織屏障和膜屏障的阻礙，還需要克服各種抗病毒機制的阻礙，如RNA干擾（RNA interference, RNAi）。RNAi是指由內(nèi)源或外源雙鏈RNA（double-stranded RNA, dsRNA）誘導(dǎo)同源mRNA發(fā)生降解的一種轉(zhuǎn)錄后基因沉默現(xiàn)象，是生物體細胞內(nèi)有效的抗病毒防御形式，也是生物體用于保護自身基因組免遭外源基因侵害的一種方

3、式。
　　為探索RRSV在其介體褐飛虱體內(nèi)的復(fù)制增殖是否受RNA干擾的調(diào)控，本實驗首先用RT-qPCR方法分析病毒侵染對RNAi途徑抗病毒途徑相關(guān)基因表達的影響。結(jié)果發(fā)現(xiàn)RRSV侵染褐飛虱培養(yǎng)細胞，能誘導(dǎo)細胞內(nèi)RNAi途徑抗病毒相關(guān)基因Argonaute1（Ago1）、Argonaute2（Ago2）、Argonaute3（Ago3）、Dicer1、Dicer2、Eri-like-1a（Eri-la）、Eri-like-1b（Er

4、i-lb）、Piwi和（systemic RNA interference defective, SID-1）等基因的相對表達量上調(diào)。接著，將體外合成的RNAi途徑相關(guān)基因片段的dsRNA轉(zhuǎn)染褐飛虱培養(yǎng)細胞，再用RRSV侵染。免疫熒光實驗結(jié)果發(fā)現(xiàn)，干擾siRNA途徑中的Dicer2和Ago2基因的表達，能顯著提高RRSV在褐飛虱培養(yǎng)細胞的侵染率，而干擾miRNA途徑中的Dicer1和Ago1基因、piRNA途徑中Piwi和Ago3基因以

5、及Eri-la和Eri-lb基因的表達不影響RRSV在褐飛虱培養(yǎng)細胞中的侵染率。上述結(jié)果表明，褐飛虱siRNA途徑參與調(diào)控了RRSV在褐飛虱培養(yǎng)細胞中的侵染復(fù)制，而miRNA途徑和piRNA途徑可能不參與調(diào)控RRSV在褐飛虱培養(yǎng)細胞中的侵染復(fù)制。RT-qPCR實驗結(jié)果也進一步表明，轉(zhuǎn)染dsDicer2和dsAgo2褐飛虱培養(yǎng)細胞，RRSV P8基因的積累量顯著提高，而轉(zhuǎn)染dsAgo1、dsAgo3、dsDicer1、dsEri-la、d

6、sEri-lb、dsPiwi和dsSID-1等dsRNA 后，RRSV P8基因的積累量無顯著變化。
　　本研究對褐飛虱抗病毒免疫方式進行了初步探究，明確了褐飛虱細胞內(nèi)siRNA途徑是調(diào)控RRSV侵染、復(fù)制增殖的有效途徑，且該途徑中發(fā)揮作用的關(guān)鍵因子為Dicer2和Ago2；而miRNA途徑和piRNA途徑可能不參與調(diào)控RRSV侵染、復(fù)制增殖。這些結(jié)果為明確植物病毒在介體昆蟲體內(nèi)受到的RNAi機制，解析病毒與介體昆蟲的互