一個(gè)水稻高葉綠素基因(OsDET1)的功能鑒定與分析.pdf

1、葉綠素是植物進(jìn)行光合作用的物質(zhì)基礎(chǔ)，通過(guò)提高葉綠素含量來(lái)提高光合作用速率可以提高作物產(chǎn)量，從而實(shí)現(xiàn)作物超高產(chǎn)目標(biāo)。本實(shí)驗(yàn)室得到一個(gè)水稻高葉綠素自然突變體材料，經(jīng)遺傳分析，高葉綠素性狀由顯性單基因控制。到目前為止，在國(guó)內(nèi)外還沒(méi)有相關(guān)水稻高葉綠素突變體性狀的報(bào)道。因而對(duì)控制該性狀的高葉綠素基因進(jìn)行克隆和功能研究，對(duì)水稻高葉綠素基因分子機(jī)理的闡述具有重要理論價(jià)值；同時(shí)對(duì)高葉綠素基因的功能研究，對(duì)發(fā)現(xiàn)潛在的功能，實(shí)現(xiàn)水稻的優(yōu)質(zhì)高產(chǎn)具有重大的現(xiàn)實(shí)

2、意義。本論文以O(shè)sDET1為候選基因，對(duì)該基因的表達(dá)量進(jìn)行研究分析，構(gòu)建了一系列表達(dá)載體并轉(zhuǎn)化煙草和水稻以實(shí)現(xiàn)對(duì)OsDET1基因的功能驗(yàn)證。以下是論文的主要結(jié)論：
　?。?）OsDET1基因的表達(dá)量分析
　　利用熒光實(shí)時(shí)定量RT-PCR（real-timequantitiveRT-PCR），以水稻野生型（珍汕97B）為對(duì)照，對(duì)OsDET1基因在不同組織器官進(jìn)行相對(duì)定量分析，發(fā)現(xiàn)OsDET1在根、葉鞘、葉片中，其野生型和突變體

3、的表達(dá)水平不一致，在葉片和葉鞘中，與野生型相比，OsDET1基因在突變體中的表達(dá)量增加了大約一倍，而在根中，與野生型相比，其OsDET1在突變體的表達(dá)量并沒(méi)有差別。
　?。?）OsDET1在水稻及煙草中的超表達(dá)研究
　　在實(shí)驗(yàn)室前期構(gòu)建的兩個(gè)表達(dá)載體pCAMBIA1301-OsDET1、pCUPHN-OsDET1的基礎(chǔ)上，將這兩個(gè)表達(dá)載體分別轉(zhuǎn)化對(duì)煙草和水稻，經(jīng)過(guò)PCR檢測(cè)，最終得到一批轉(zhuǎn)基因陽(yáng)性水稻和煙草植株。
　　

4、利用半定量PCR（semi-quantitativePCR）對(duì)OsDET1基因進(jìn)行表達(dá)量分析，分析結(jié)果發(fā)現(xiàn)：與野生型相比，轉(zhuǎn)基因水稻植株葉中OsDET1基因的表達(dá)量明顯提高，提高了2.7倍；測(cè)定轉(zhuǎn)基因水稻葉片葉綠素含量，結(jié)果證明：與野生型相比，轉(zhuǎn)基因水稻植株的葉綠素a、b含量分別提高了60％和59％。
　?。?）OsDET1基因干擾載體的構(gòu)建及對(duì)水稻的遺傳轉(zhuǎn)化
　　本章構(gòu)建了兩個(gè)干擾載體：一個(gè)全長(zhǎng)干擾載體和部分干擾載體。將干

5、擾載體轉(zhuǎn)化水稻愈傷，通過(guò)PCR和GUS檢測(cè)，最終證明干擾載體成功轉(zhuǎn)入水稻愈傷，對(duì)轉(zhuǎn)基因植株進(jìn)行OsDET1基因的表達(dá)量分析，發(fā)現(xiàn)與野生型相比，干擾植株的OsDET1基因的表達(dá)量并沒(méi)有差別。
　?。?）OsDET1基因的亞細(xì)胞定位
　　通過(guò)農(nóng)桿菌介導(dǎo)法將OsDET1-GFP重組質(zhì)粒導(dǎo)入洋蔥表皮細(xì)胞進(jìn)行瞬時(shí)表達(dá)，在熒光顯微鏡下觀察，亞細(xì)胞定位結(jié)果表明OsDET1基因所表達(dá)的蛋白位于細(xì)胞核內(nèi)。
　?。?）OsDET1基因的啟