EPSPS基因的克隆及轉(zhuǎn)化甜高粱的初步研究.pdf

1、5-烯醇丙酮酰.莽草酸-3-磷酸合成酶(5-enolpyruvyl-shikimate-3-phosphatesynthase)基因，簡(jiǎn)稱EPSPS基因，植物細(xì)胞主要通過(guò)EPSPS作用活性位點(diǎn)變化產(chǎn)生對(duì)除草劑草甘膦的抗性，即我們通常所說(shuō)的EPSPS抗草甘膦基因。目前在美國(guó)普及的抗草甘膦大豆就是根據(jù)這個(gè)作用機(jī)理研制而成的，它的外源基因最初來(lái)自土壤桿菌(Agrobacterium sp.)CP4菌株中的EPSP合成酶基因，簡(jiǎn)稱CP4-EPS

2、PS基因。
　　 甜高粱是目前公認(rèn)的最具優(yōu)勢(shì)的糖料作物、飼料作物和能源作物。然而截止目前，在生產(chǎn)上，抗逆性狀優(yōu)良的甜高粱品種仍需進(jìn)一步去改造。利用轉(zhuǎn)基因技術(shù)，對(duì)現(xiàn)有的甜高粱品種進(jìn)行性狀改良及分子遺傳學(xué)基礎(chǔ)研究具有很大的意義，其中抗除草劑性能也是一個(gè)非常重要的方面。為了有望能夠獲得高抗逆性的新品種，建立甜高粱高效穩(wěn)定的遺傳轉(zhuǎn)化體系起到了關(guān)鍵作用，它對(duì)研制轉(zhuǎn)基因抗除草劑甜高粱新品種顯得尤為重要。
　　 本研究從抗草甘膦轉(zhuǎn)基因

3、大豆中克隆出EPSPS基因，構(gòu)建好植物表達(dá)載體，然后導(dǎo)入農(nóng)桿菌，以供下一步的遺傳轉(zhuǎn)化。并以引種至廣西南寧種植的北甜三號(hào)(BT3)的成熟種子為外植體，先建立了高效、穩(wěn)定的再生體系，再探討了農(nóng)桿菌介導(dǎo)的遺傳轉(zhuǎn)化。目前取得的主要研究結(jié)果如下：
　　 1、從抗草甘膦大豆中克隆到EPSPS基因全長(zhǎng)，測(cè)序驗(yàn)證序列完全正確，該片段全長(zhǎng)1368 bp，共編碼455個(gè)氨基酸。以植物表達(dá)載體PCAMBIA1300為載體，UBI和NOS分別為啟動(dòng)子和

4、終止子，構(gòu)建了EPSPS表達(dá)載體。
　　 2、建立了高效穩(wěn)定的甜高粱BT3組織培養(yǎng)再生體系。以成熟種子為外植體，采用95％酒精處理30-50 s，無(wú)菌水沖洗一次，再用0.2％的升汞處N23 min，無(wú)菌水沖洗3-4次可以達(dá)到理想的消毒效果。最佳誘導(dǎo)胚性愈傷的培養(yǎng)基為MS+2.0mg/L2，4-D+0.05 mg/L6-BA；有效的增殖培養(yǎng)基為MS+1.5 mg/L2，4.D+0.05 mg/L6-BA；高效的分化培養(yǎng)基為MS+1

5、.0 mg/L6-BA+0.1 mg/L NAA；生根培養(yǎng)基為1/2MS+0.05 mg/L IBA和1/2MS+2.0 mg/L IBA均可。
　　 3、篩選出甜高粱胚性愈傷的潮霉素抗性臨界濃度為75 mg/L，25 mg/L的潮霉素濃度完全不能抑制住非轉(zhuǎn)基因愈傷的生長(zhǎng)，50 mg/L潮霉素濃度培養(yǎng)基上還會(huì)產(chǎn)生個(gè)別數(shù)量的新愈傷，100 mg/L濃度下愈傷全部迅速死亡，而75 mg/L濃度培養(yǎng)基上還會(huì)產(chǎn)生1.11％的新愈傷存活率