黃瓜CDPK基因的克隆及遺傳轉(zhuǎn)化.pdf

1、黃瓜是一種重要的世界性蔬菜，黃瓜生產(chǎn)過程中對氮肥的需求量較大。隨著生產(chǎn)者對黃瓜產(chǎn)量和效益追求的不斷提高，在黃瓜生產(chǎn)過程中氮肥施用量就不斷的增加，黃瓜的生產(chǎn)成本不斷提升，造成農(nóng)民的生產(chǎn)負(fù)擔(dān)越來越重，而且氮肥施用量的增加還使得黃瓜果實中亞硝酸鹽含量增加，影響黃瓜的品質(zhì)和人類的健康，并且大量的氮肥揮發(fā)到空氣中污染大氣或隨著雨水流到湖泊、海洋污染水體等造成環(huán)境污染。因此，提高黃瓜品種的耐低氮性，不僅可以有效減少氮肥施用量，降低生產(chǎn)成本，減少對環(huán)

2、境的污染，而且還可以減少黃瓜果實中硝酸鹽的積累，防止對人類健康的危害。
　　 鈣依賴蛋白激酶CDPKs(Calcium-dependent Protein Kinases，CDPKs)，磷酸化蔗糖合成途徑的關(guān)鍵酶——蔗糖磷酸合成酶(SPS)和硝酸鹽同化氮素的限速酶——硝酸還原酶(NR)，參與植物的碳氮代謝和抗逆反應(yīng)。本試驗室前期在對低氮脅迫下黃瓜葉片Solexa測序研究中發(fā)現(xiàn)黃瓜葉片中的CDPK基因在低氮脅迫下表達(dá)量增加，推測C

3、DPK基因可能參與了低氮脅迫中某些信號的轉(zhuǎn)導(dǎo)，提高黃瓜的耐低氮能力。因此，進(jìn)行黃瓜CDPK基因的克隆及其對黃瓜和擬南芥的轉(zhuǎn)化，可為揭示該基因在低氮脅迫中的作用機(jī)理以及耐低氮黃瓜新種質(zhì)資源創(chuàng)新奠定基礎(chǔ)。
　　 本試驗通過PCR的方法成功克隆了黃瓜葉片CDPK基因，并對其核苷酸序列與預(yù)測的氨基酸序列進(jìn)行了分析。在此基礎(chǔ)上構(gòu)建了PBI１21-CDPK植物表達(dá)載體。通過農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化，獲得過量表達(dá)和干擾表達(dá)該基因的黃瓜和擬南芥植株。主要研究

4、結(jié)果如下:
　　 (1)采用RT-PCR方法從黃瓜品種津研四號葉片中成功克隆得到CDPK基因。CDPK基因編碼區(qū)全長1584bp，編碼527個氨基酸，分子量為60007.514 Da，等電點為5.34。該基因編碼的蛋白是一個穩(wěn)定的親水蛋白，無跨膜結(jié)構(gòu)，無信號肽，存在EF手型鈣結(jié)合區(qū)，絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶活性位點，氮糖基化位點等多個位點。同源比對發(fā)現(xiàn)，黃瓜CDPK基因編碼的蛋白與葡萄、毛果楊、蓖麻CDPK基因編碼蛋白同源性高達(dá)7