黃瓜白果皮顏色基因遺傳轉(zhuǎn)化與功能分析.pdf

1、果皮顏色是黃瓜(Cucumis sativus L.)品種改良的一個(gè)重要品質(zhì)性狀，本研究以嫩果皮白色自交系H4為母本，墨綠色自交系Q1為父本，通過(guò)雜交獲得F1，自交后得到分離群體F2。通過(guò)葉綠素含量的測(cè)定和葉綠體透射電鏡觀察，探究引起黃瓜嫩果皮白色的內(nèi)在生理機(jī)理。同時(shí)在董緒(2015)對(duì)黃瓜白果皮顏色基因研究基礎(chǔ)上，進(jìn)一步用圖位克隆法縮小候選基因區(qū)域，并通過(guò)實(shí)時(shí)熒光定量PCR分析、TA克隆測(cè)序技術(shù)篩選控制黃瓜嫩果皮顏色的候選基因，最終轉(zhuǎn)

2、化驗(yàn)證候選基因。主要研究結(jié)果如下:
　　1.葉綠素含量測(cè)定和葉綠體透射電鏡觀察
　　黃瓜嫩果皮墨綠色自交系Q1的葉綠素含量比嫩果皮白色自交系H4高，其中以果皮葉綠素含量差異最大。通過(guò)葉綠體透射電鏡觀察兩親本果皮的葉綠體數(shù)量和亞顯微結(jié)構(gòu)，發(fā)現(xiàn)嫩果皮白色自交系H4的葉綠體內(nèi)部明顯空化，出現(xiàn)提前衰老，缺乏淀粉粒，基粒類囊體降解，質(zhì)體內(nèi)部結(jié)構(gòu)模糊。與Q1相比，H4的總質(zhì)體數(shù)目減少，葉綠體數(shù)量少且體積小。
　　2.標(biāo)記篩選與基因

3、定位
　　在前人將控制黃瓜白果皮性狀的目標(biāo)基因定位在3號(hào)染色體末端的基礎(chǔ)上，開(kāi)發(fā)了63對(duì)CAPS標(biāo)記，在Q1、H4和F1中篩選得到5對(duì)多態(tài)性標(biāo)記，然后選取1655株嫩果皮白色F2單株進(jìn)行基因定位，通過(guò)兩個(gè)側(cè)翼標(biāo)記Q147和Q193將候選區(qū)域縮小至100.3kb，包含13個(gè)候選基因。
　　3.實(shí)時(shí)熒光定量PCR分析
　　分析13個(gè)候選基因在Q1和H4不同組織中的表達(dá)量差異，發(fā)現(xiàn)，Csa3G904080在授粉后8d和13d

4、果皮中的表達(dá)量差異分別為1.86倍和2.42倍，Csa3G904110在授粉后8d和13d果皮中的表達(dá)量差異分別為1.59倍和6.15倍，Csa3G904130在授粉后8d和13d果皮中的表達(dá)量差異分別為5.34倍和9.19倍，Csa3G904140在授粉后8d和13d果皮中的表達(dá)量差異分別為5.01倍和22.63倍，其余9個(gè)基因表達(dá)量差異不明顯。進(jìn)一步分析基因Csa3G904080、Csa3G904110、Csa3G904130、Cs

5、a3G904140在黃瓜不同組織部位中的表達(dá)量差異，基因Csa3G904080在根和莖中的表達(dá)量最高;基因Csa3G904110在根、莖和果皮中均有高表達(dá);基因Csa3G904130的表達(dá)量在果皮中差異明顯，同時(shí)在根中也有明顯差異;基因Csa3G904140在果皮中的表達(dá)量差異明顯，在其它組織部位幾乎無(wú)差異。
　　4.TA克隆測(cè)序
　　首先分析表達(dá)量有差異的基因在Q1和H4中的編碼序列，發(fā)現(xiàn)Csa3G904080的編碼序列存

6、在3個(gè)SNP突變導(dǎo)致3個(gè)氨基酸變化;基因Csa3G904110有2個(gè)SNP同義突變，無(wú)氨基酸改變;基因Csa3G904130的CDS序列在兩個(gè)親本中一致，沒(méi)有發(fā)生突變;基因Csa3G904140在第九個(gè)外顯子末端有一個(gè)堿基G插入，導(dǎo)致移碼突變提前終止翻譯。分析發(fā)現(xiàn)，Csa3G904080和Csa3G904140的SNP突變?cè)趃DNA中也存在，在17份綠色/白色黃瓜種質(zhì)資源測(cè)序結(jié)果表明，Csa3G904080三個(gè)外顯子的SNP突變與表型不