火龍果CAT基因在煙草中的遺傳轉(zhuǎn)化及功能分析.pdf

1、逆境脅迫嚴(yán)重影響植物的分布、生長(zhǎng)發(fā)育及品質(zhì)的形成。在逆境脅迫下，植物積累了大量的活性氧（ROS），從而導(dǎo)致膜脂、DNA及其他細(xì)胞組分的嚴(yán)重?fù)p傷。過(guò)氧化氫酶（CAT）屬血紅蛋白酶類，主要催化H2O2分解為H2O與O2， CAT的過(guò)量表達(dá)可有效清除植株體內(nèi)的ROS，提高其對(duì)氧化脅迫的抗性。
　　火龍果(Hylocereus undulatus)為仙人掌科三角柱屬的果用栽培種，原產(chǎn)于中美洲熱帶沙漠地區(qū)，耐熱耐旱，具有很高的利用價(jià)值。前期

2、工作中，我們克隆了火龍果CAT基因（HuCAT），并在mRNA水平上分析了該基因與非生物脅迫的關(guān)系。本文擬構(gòu)建HuCAT的植物表達(dá)載體，并通過(guò)遺傳轉(zhuǎn)化模式植物煙草，在干旱與低溫逆境脅迫下對(duì)轉(zhuǎn)基因煙草的生理指標(biāo)進(jìn)行分析，以期進(jìn)一步探討HuCAT的高效超表達(dá)提高植物抗逆性的潛在功能。主要結(jié)果如下：
　　1、據(jù)前期克隆的火龍果過(guò)氧化氫酶基因（HuCAT）設(shè)計(jì)特異引物，從克隆載體PMD18T-HuCAT中擴(kuò)增出特異帶，將其連入植物表達(dá)載體

3、pSH737，構(gòu)建了CaMV35s啟動(dòng)子驅(qū)動(dòng)的表達(dá)載體pSH737-HuCAT。
　　2、采用農(nóng)桿菌介導(dǎo)法轉(zhuǎn)化煙草，獲得37個(gè)抗性植株，經(jīng)GUS組織化學(xué)染色及PCR擴(kuò)增鑒定，有29個(gè)株系為轉(zhuǎn)基因植株；經(jīng)半定量RT-PCR及熒光定量PCR檢測(cè)，篩選出高表達(dá)株系22個(gè)。
　　3、以PEG-6000溶液模擬干旱脅迫條件，測(cè)定轉(zhuǎn)基因煙草的抗旱相關(guān)生理指標(biāo)。結(jié)果顯示，轉(zhuǎn)基因植株水勢(shì)、過(guò)氧化氫酶（CAT）、超氧化物歧化酶（SOD）和過(guò)氧

4、化物酶（POD）活性、葉綠素、可溶性糖（SS）、可溶性蛋白（SP）和脯氨酸（PRO）含量、相對(duì)含水量均高于野生型；丙二醛（MDA）含量、過(guò)氧化氫（H2O2）含量、相對(duì)電導(dǎo)率低于野生型，說(shuō)明轉(zhuǎn)HuCAT基因提高了煙草的抗旱性。
　　4、在恒溫光照培養(yǎng)箱里低溫（4℃）處理2天，轉(zhuǎn)基因煙草CAT、SOD和POD活性，可溶性糖、可溶性蛋白及PRO含量均高于野生型，而MDA含量低于野生型，意味著轉(zhuǎn)HuCAT基因提高了煙草的抗寒性。