抗蟲基因EQKAM在黃瓜上的遺傳轉(zhuǎn)化研究.pdf

1、黃瓜是一種重要的蔬菜作物，栽培歷史悠久，在我國乃至世界范圍栽培面積廣泛。但由于蚜蟲、茶黃螨、白粉虱、薊馬等的危害，給黃瓜生產(chǎn)時(shí)常造成重大損失。而且由于害蟲防治引發(fā)的農(nóng)藥殘留、環(huán)境污染、害蟲抗藥性、生態(tài)平衡破壞等一系列問題，已引起人們的廣泛關(guān)注。選育抗蟲黃瓜新品種是持續(xù)控制害蟲的根本措施，但由于黃瓜抗蟲資源缺乏，限制了黃瓜抗蟲育種研究。通過基因工程方法將外源抗蟲基因?qū)朦S瓜，創(chuàng)造黃瓜抗蟲新材料，是一種較常規(guī)育種更為有效、快速的方法，是育種

2、家關(guān)注的一個(gè)重要課題。 本研究的目的是建立高效的黃瓜遺傳轉(zhuǎn)化體系，通過農(nóng)桿菌介導(dǎo)法和花粉管通道法將抗蟲基因EQKAM轉(zhuǎn)入黃瓜，獲得黃瓜轉(zhuǎn)基因陽性植株，為進(jìn)一步獲得抗蟲黃瓜新品種奠定基礎(chǔ)。 通過對苗齡、品種、外植體類型、生長激素種類及濃度、分裂素濃度、糖源種類及濃度等影響器官發(fā)生的因素進(jìn)行研究，建立了高效、穩(wěn)定的黃瓜離體體細(xì)胞再生體系：以培養(yǎng)3-4天的無菌苗子葉為外植體，誘導(dǎo)培養(yǎng)基以MS為基本培養(yǎng)基，附加BA2.0mg/L

3、，NAA0.5 mg/L，ABA10mg/L，蔗糖60g/L，瓊脂7g/L。該體系對多數(shù)黃瓜材料出芽率和每外植體出芽數(shù)均較高，其中T55材料，每外植體出芽數(shù)最多可達(dá)3.82。該體系可應(yīng)用于農(nóng)桿菌介導(dǎo)的遺傳轉(zhuǎn)化。 對農(nóng)桿菌介導(dǎo)的遺傳轉(zhuǎn)化體系進(jìn)行優(yōu)化研究，結(jié)果表明：以子葉為外植體，采用切成兩塊法，近生長點(diǎn)部位插入培養(yǎng)基，在菌液和共培養(yǎng)中加入乙酰丁香酮，采用前7天卡那霉素延遲篩選方法為較好的農(nóng)桿菌介導(dǎo)的遺傳轉(zhuǎn)化體系。最高抗性芽出芽率可

4、為17％。共再生植株40株，田間移栽成活32株，PCR檢測陽性植株5株，陽性植株轉(zhuǎn)化率為1.02％。 研究了各種花粉管通道法對黃瓜遺傳轉(zhuǎn)化的效果，比較了子房注射法、柱頭涂抹法、切割柱頭法等對座瓜、結(jié)籽及轉(zhuǎn)化率的影響。通過比較黃瓜幼苗在不同濃度卡那霉素培養(yǎng)基上的生長表現(xiàn)，確立了陽性植株的篩選方法：播種于Kan 40mg/L瓊脂培養(yǎng)基上7-10天后，轉(zhuǎn)入Kan 200mg/L營養(yǎng)液中生長3-4天，剪掉根系并用生長素浸泡1天后扦插于蛭