農(nóng)桿菌介導(dǎo)的雙價抗蟲基因Pta-CrylAc番茄的遺傳轉(zhuǎn)化研究.pdf

1、本研究優(yōu)化了番茄的再生體系和農(nóng)桿菌介導(dǎo)的番茄轉(zhuǎn)化體系，并構(gòu)建了應(yīng)用于農(nóng)桿菌介導(dǎo)法轉(zhuǎn)化的雙價抗蟲載體pCAMBIA3300-bt-pta，以番茄品系Micro-Tom為材料進行了番茄轉(zhuǎn)化、轉(zhuǎn)化番茄的分子生物學(xué)鑒定以及遺傳學(xué)分析，并初步進行了轉(zhuǎn)基因番茄的抗蟲鑒定工作，主要結(jié)果如下： 1優(yōu)化了農(nóng)桿菌介導(dǎo)番茄轉(zhuǎn)化的幾個影響因素：①外植體長度在5mm左右有利于愈傷組織的形成；②光照培養(yǎng)比暗培養(yǎng)更有利于愈傷組織的形成；③農(nóng)桿菌侵染時間為8-

2、10分鐘；④菌液濃度OD600約為0.15；⑤侵染液pH=5.2；⑥乙酰丁香酮使用濃度為50μmol/L；⑦共培養(yǎng)時間為三天時獲得了最高的轉(zhuǎn)化效率；⑧選用羧芐青霉素為抑菌劑，濃度為300mg/l；⑨以PPT作為選擇劑時的濃度為4mg/l。 2以pCAMBIA3300為骨架，在此基礎(chǔ)上構(gòu)建了含半夏凝集素和蘇云金芽孢桿菌的雙價抗蟲載體，并以根癌農(nóng)桿菌LBA1100為侵染菌轉(zhuǎn)化番茄。并且，轉(zhuǎn)化后從325個外植體獲得再生植株24株，再生

3、率為8.5﹪。 3對轉(zhuǎn)化的24株再生植株中進行了PCR檢測、RT-PCR檢測以及Southernblot檢測，并且確定陽性植株為15株，轉(zhuǎn)化率為62.5﹪。 4對T1植株進行了抗蟲基因CrylAc分離分析，結(jié)果符合孟德爾規(guī)律，陽性和陰性之比為3：1；并且抗蟲基因CrylAc和抗蟲基因Pta共分離。 5對T1植株進行了除草劑抗性檢測，抗除草劑有效成分PPT在20mg/l。 6對T1代植株BP-1～BP-7進