辣椒高效遺傳轉(zhuǎn)化體系的建立及其在NAC，CDPK，CIPK等候選基因遺傳轉(zhuǎn)化中的應(yīng)用.pdf

1、辣椒(Capsicum annuum L)是一種重要的蔬菜和工業(yè)原料作物，遺傳轉(zhuǎn)化是其基因工程遺傳改良和功能基因組學(xué)研究的重要基礎(chǔ)。但是，目前辣椒的遺傳轉(zhuǎn)化體系還不完善，主要缺陷是：辣椒再生周期長(zhǎng)，分化頻率低，不定芽的伸長(zhǎng)能力差，遺傳轉(zhuǎn)化頻率低等，限制了基因工程在辣椒遺傳改良上的有效應(yīng)用和辣椒功能基因組學(xué)研究的進(jìn)展，亟待建立高效的遺傳轉(zhuǎn)化體系。本研究采用L120，L63(朝天椒)， L3(本地種)，L5(天鷹小椒)等九種辣椒資源，對(duì)辣椒

2、再生的芽誘導(dǎo)，芽伸長(zhǎng)和生根的激素配比，培養(yǎng)基的選擇，基因型，外植體類(lèi)型進(jìn)行了比較分析，建立起了辣椒再生體系，并在再生體系的基礎(chǔ)上對(duì)辣椒遺傳轉(zhuǎn)化的預(yù)培養(yǎng)，共培養(yǎng)和侵染的時(shí)間，Kan篩選濃度進(jìn)行了反復(fù)實(shí)驗(yàn)，建立了高效的遺傳轉(zhuǎn)化體系，通過(guò)農(nóng)桿菌介導(dǎo)的葉盤(pán)法和Flamingo-bill外植體遺傳轉(zhuǎn)化法，并應(yīng)用該體系對(duì)NAC1、CDPK和CIPK等候選基因的超表達(dá)和RNAi載體進(jìn)行遺傳轉(zhuǎn)化，一方面驗(yàn)證該遺傳轉(zhuǎn)化體系應(yīng)用效率，另一方面為進(jìn)一步開(kāi)展所

3、選用的候選基因的功能鑒定奠定基礎(chǔ)。試驗(yàn)的主要結(jié)論如下： 1、離體再生體系的建立 在辣椒再生過(guò)程中，不同外植體的芽誘導(dǎo)差別較大，其中帶柄子葉>子葉>下胚軸。苗齡為12-16d的外植體最適宜再生誘導(dǎo)，辣椒基因型直接著影響芽誘導(dǎo)率。經(jīng)過(guò)篩選激素配比，得出以下各階段培養(yǎng)基配方：子葉芽分化培養(yǎng)基：MB+5mg/L6-BA+0.1mg/L IAA+4mg/L AgNO3+30g/L蔗糖+7g/L瓊脂粉；下胚軸芽分化培養(yǎng)基：MB+3m

4、g/L6-BA+1mg/L IAA+4mg/LAgNO3+30g/L蔗糖+7g/L瓊脂粉；芽伸長(zhǎng)培養(yǎng)基：MB+3 mg/L6-BA+1 mg/L IAA+1.5 mg/LGA3+4mg/L AgNO3+30g/L蔗糖+7g/L瓊脂粉；生根培養(yǎng)基1/2MB+0.2mg/L IAA+0.1mg/LNAA+30g/L蔗糖+7g/L瓊脂粉；6-BA+1AA+ GA3配方的伸長(zhǎng)效果優(yōu)于ZT+ GA3的配方。GA3與ABA的相比較，GA3更利于芽的

5、伸長(zhǎng)。誘導(dǎo)芽經(jīng)過(guò)18-22d左右的分化培養(yǎng)最適宜后期的伸長(zhǎng)生長(zhǎng)。 2、遺傳轉(zhuǎn)化體系的建立與優(yōu)化 遺傳轉(zhuǎn)化過(guò)程中，不同生長(zhǎng)階段的選擇壓有區(qū)別，芽分化階段采用75 mg/L的Kan，芽伸長(zhǎng)階段，子葉和下胚軸分別用50 mg/L和75mg/L Kan進(jìn)行選擇，分化和伸長(zhǎng)階段均使用500mg/L羧芐青霉素能有效抑制農(nóng)桿菌的生長(zhǎng)。生根階段的Kan濃度為40 mg/L，并以200 mg/L的頭孢霉素代替羧芐青霉素，有利于根的形成。預(yù)

6、培養(yǎng)最佳時(shí)間3d，共培養(yǎng)2d。OD600=0.6的農(nóng)桿菌侵染適宜時(shí)間為6～8min。Flamingo-bill外植體法，帶柄子葉，子葉塊的遺傳轉(zhuǎn)化率分別是6.8％，12.1％，4.3％，陽(yáng)性轉(zhuǎn)化率分別是33％，23.6％，21.1％。 3、遺傳轉(zhuǎn)化體系的應(yīng)用與候選基因轉(zhuǎn)化植株的獲得 應(yīng)用遺傳轉(zhuǎn)化體系和L120辣椒基因型對(duì)超表達(dá)載體和RNAi載體的NAC1基因以及候選基因CDPK和CIPK進(jìn)行了遺傳轉(zhuǎn)化，其中超表達(dá)載體NA