EPSPS基因Bar基因的克隆及在蓖麻中的功能驗(yàn)證.pdf

1、蓖麻（Ricinus communisL.）是世界十大油料作物之一。目前，尚未有轉(zhuǎn)基因抗除草劑蓖麻品種。本試驗(yàn)以蓖麻優(yōu)良父本“2129”為試驗(yàn)材料，通過(guò)PCR擴(kuò)增法，克隆EPSPS基因和Bar基因，構(gòu)建植物表達(dá)載體pCAMBIA3301-Bar-EPSPS，利用農(nóng)桿菌介導(dǎo)法將EPSPS基因和Bar基因同時(shí)轉(zhuǎn)到蓖麻體內(nèi)。為培育具有抗除草劑的蓖麻新品種奠定基礎(chǔ)。本試驗(yàn)的研究結(jié)果如下:
　　1、根據(jù)GenBank中公布的EPSPS基因序

2、列以及重疊延伸PCR的原理，設(shè)計(jì)了19對(duì)引物，引物長(zhǎng)度為60pb，并且相鄰兩個(gè)引物之間有20pb的堿基重疊，在第19對(duì)引物的兩端加入酶切位點(diǎn)XhoⅠ。根據(jù)Bar基因序列及重疊延伸PCR的原理，設(shè)計(jì)11對(duì)引物，引物長(zhǎng)度為60bp，并且相鄰引物之間有20bp堿基重疊，在第11對(duì)引物的兩端分別添加酶切位點(diǎn)NcoⅠ、BstEⅡ。采用PCR擴(kuò)增法，獲得EPSPS基因和Bar基因的全長(zhǎng)序列，分別經(jīng)回收、連接、轉(zhuǎn)化、鑒定、測(cè)序、分析比對(duì)后，得到EPS

3、PS、Bar基因1529bp、831 bp全長(zhǎng)序列。
　　2、將表達(dá)載體質(zhì)粒pCAMBIA3301線性化，用NcoⅠ、BstEⅡ?qū)ar基因從克隆載體上切下，然后將二者連接，經(jīng)轉(zhuǎn)化、鑒定，獲得pCAMBIA3301-Bar質(zhì)粒。用XhoⅠ將pCAMBIA3301-Bar線性化，將EPSPS基因從克隆載體上切下，將二者連接，經(jīng)轉(zhuǎn)化、鑒定，獲得pCAMBIA3301-Bar-EPSPS表達(dá)載體，并確定EPSPS基因連接方向正確。