真菌溶磷相關(guān)基因的克隆與功能驗(yàn)證.pdf

1、磷素是植物生長(zhǎng)發(fā)育必需的元素之一，施用磷肥是確保糧食高產(chǎn)穩(wěn)產(chǎn)的重要措施。長(zhǎng)期大量磷肥使用，導(dǎo)致土壤固定和土壤中磷素大量累積。溶磷微生物在土壤磷素循環(huán)中起著重要作用，將難溶磷轉(zhuǎn)化為有效磷。篩選高效穩(wěn)定的溶磷菌株、深入開(kāi)展溶磷和促生機(jī)理、以及克隆溶磷相關(guān)基因等研究，對(duì)溶磷微生物在農(nóng)業(yè)生產(chǎn)中廣泛應(yīng)用具有重要意義。
　　本研究從內(nèi)蒙古巴彥淖爾市鹽堿土中分離篩選了5株高效溶磷菌株，重點(diǎn)研究了日本曲霉M1和草酸青霉M2的溶磷能力、促生效果、溶

2、磷和促生機(jī)理。液體搖床條件下培養(yǎng)6d，以Ca3(PO4)2為磷源，菌株M1、M2的溶磷效果最優(yōu)，有效磷達(dá)102089mg/L和971.87mg/L;以AlPO4為磷源，溶磷效果最佳的為菌株M1和M2，有效磷達(dá)995.69和987.74mg/L。菌株M1和M2分別接入含有5種磷礦粉培養(yǎng)液中，菌株M1和M2最高溶磷量分別為363.64mg/L和55583mg/L。盆栽試驗(yàn)中，將M1、M2菌株各自制備的菌劑分別接種于3種磷源的4種土壤。結(jié)果顯

3、示，菌株M1、M2對(duì)玉米植株促生效果顯著，接種菌株M1、M2處理的玉米植株鮮重比CK提高2.14％～9091％、干重增加22.15％～268.28％，土壤有效磷提高21.81mg/kg～24.27mg/kg。菌株M1與4種土壤的適配性均高于對(duì)照菌株黑曲霉DSM821與斜臥青霉P83。
　　借助LC-MS方法，測(cè)定出日本曲霉菌M1和草酸青霉菌M2在磷酸三鈣、磷酸鋁和開(kāi)陽(yáng)磷礦粉培養(yǎng)液中，分泌的有機(jī)酸和植物激素。菌株M1、M2分別接入磷

4、酸三鈣、磷酸鋁和開(kāi)陽(yáng)磷礦粉3種難溶磷培養(yǎng)液中經(jīng)過(guò)6d培養(yǎng)均產(chǎn)生7種有機(jī)酸，其中草酸和檸檬酸含量最高，M1產(chǎn)生的草酸和檸檬酸含量分別為61616mg/L和41369mg/L，M2產(chǎn)生的草酸和檸檬酸含量分別為623.34mg/L和437.21mg/L;培養(yǎng)液均能檢測(cè)到吲哚乙酸(IAA)和玉米素，IAA含量為15.45～77.58mg/L，玉米素濃度為0.06～0.11mg/L。
　　通過(guò)SMART技術(shù)，成功構(gòu)建出了日本曲霉M1和草酸青

5、霉M2的cDNA文庫(kù)。插入載體中的基因長(zhǎng)度主要為1000-1500bp，通過(guò)藍(lán)白斑篩選重組率，菌株M1重組率為99.91％;菌株M2重組率為99.93％。菌株M1構(gòu)建文庫(kù)滴度為6.19×106cfu/mL，菌株M2構(gòu)建文庫(kù)滴度為6.43×106cfu/mL。
　　在草酸青霉M2構(gòu)建的cDNA文庫(kù)中，共篩選到64個(gè)具有溶磷能力的克隆子，在具有穩(wěn)定溶磷功能的克隆子中，通過(guò)測(cè)序獲得4條溶磷相關(guān)基因片段，分別命名為基因psf-p1、psf

6、-p2、psf-p3和psf-p4。4個(gè)溶磷相關(guān)基因的CDS全長(zhǎng)分別為2427bp、1846bp、1161bp和1035bp;蛋白PSF-p1、PSF-p2、PSF-p3和PSF-p4分別含有681、483、251和80個(gè)氨基酸殘基。將4個(gè)溶磷基因和相應(yīng)的蛋白序列分別在NCBI中進(jìn)行比對(duì)，基因psf-p1與Penicillium decumbens strain114-2(KC1213141)相似性為99％、基因psf-p2與Penic

7、illium decumbens strain114-2(KC1213141)相似性為100％、基因psf-p3與Penicillium expansum strain HAD超家族水解酶（XM_0167445711）相似性為78％、基因psf-p4與Penicillium chrysogenum strain Wisconsin54-1255(XM_0025593411)相似性為74％。PSF-p1蛋白與草酸青霉114-2推定蛋白PD

8、E05949(EPS309951)相似性為99％，推定蛋白功能未知;PSF-p2蛋白與Penicillium decumbens胞內(nèi)β-葡萄糖苷酶(AGC10824)相似性為99％,尚無(wú)溶磷功能報(bào)道;Psf-p3蛋白與草酸青霉的推定蛋白PDE_09609(EPS346451)相似性為99％,推定蛋白功能未知;PSF-p4蛋白在NCBI中完全沒(méi)有相似性蛋白序列。毫無(wú)疑問(wèn)，本研究篩選得到的4條溶磷相關(guān)基因全部為新基因。
　　克隆子sf