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文檔簡介
1、蛻皮激素控制昆蟲發(fā)育、繁殖等過程。蛻皮激素從膽固醇而生物合成。幾個(gè)不同的由Halloween基因編碼的細(xì)胞色素P450單加氧酶催化關(guān)鍵步驟。但蛻皮激素合成過程中涉及到的相關(guān)P450酶只在有限的幾種昆蟲中得到驗(yàn)證。RNA干擾(RNAi)技術(shù)可以通過沉默靶標(biāo)基因而研究基因的功能。因此,導(dǎo)入dsRNA干擾昆蟲體內(nèi)內(nèi)源基因的表達(dá),進(jìn)而研究此基因功能的方法在昆蟲中得到廣泛應(yīng)用。
本文搜索了重要的水稻害蟲——灰飛虱和白背飛虱的轉(zhuǎn)錄組中蛻皮
2、激素生物合成過程中相關(guān)的五個(gè)Halloween基因,采用RT-PCR、RACE技術(shù)獲得了Halloween基因的cDNA全長;利用飼喂dsRNA的方法研究了Halloween基因被干擾后分別對(duì)灰飛虱和白背飛虱的生物學(xué)效應(yīng)。研究結(jié)果總結(jié)如下。
1.白背飛虱和灰飛虱蛻皮激素合成過程中相關(guān)Halloween基因的克隆
通過RT-PCR和RACE技術(shù),分別獲得了白背飛虱和灰飛虱的5個(gè)Halloween基因的全長cDNA序列,
3、并命名為SfCYP306A1、LsCYP306A1、SfCYP302A1、LsCYP302A1、SfCYP314A1、LsCYP314A1、SfCYP315A1、LsCYP315A1、SfCYP307A1和LsCYP307A1。其中SfCYP306A、LsCYP306A、SfCYP302A1、LsCYP302A1、SfCYP314A1、LsCYP314A1和LsCYP315A1有五個(gè)保守的P450區(qū)域,即WxxxR(Helix-C)、G
4、xE/DTT/S(Helix-I)、ExxR(Helix-K)、PxxFxPE/DRF(PERF motif)和血紅素結(jié)合區(qū)域PFxxGxRxCxG/A。而白背飛虱的CYP315A1僅獲得部分序列,丟失了兩個(gè)C端的保守區(qū)域,即PERF區(qū)域和血紅素結(jié)合區(qū)域。SfCYP307A1和LsCYP307A1基因序列中,Helix-C和Helix-I并不是保守的,但是在昆蟲中這些假定區(qū)域的序列非常相似。系統(tǒng)進(jìn)化樹分析將其分為CYP2分支和線粒體分支
5、。前者包括CYP307A和CYP306A亞支,后者包括CYP315A1、CYP302A1和CYP314A亞支。
2.白背飛虱和灰飛虱蛻皮激素合成過程中相關(guān)Halloween基因的表達(dá)動(dòng)態(tài)
分別測定了白背飛虱和灰飛虱的5個(gè)Halloween基因分別在4齡和5齡初期的表達(dá)量。在白背飛虱中,它們?cè)谒凝g若蟲的第一天和五齡若蟲第一天都高表達(dá),在四齡若蟲的第二天和第三天,Halloween基因的表達(dá)水平急劇下降。在灰飛虱中,這5
6、個(gè)Halloween基因在四齡若蟲的第二天和第五天存在兩個(gè)表達(dá)高峰,四齡若蟲第一天和五齡若蟲第一天存在兩個(gè)表達(dá)低谷。因此可以推斷,白背飛虱和灰飛虱Halloween基因時(shí)相表達(dá)模式與血淋巴中蛻皮激素的滴度一致。
3.RNAi介導(dǎo)的Halloween基因功能驗(yàn)證
以喂食dsRNA的方法對(duì)白背飛虱二齡若蟲和灰飛虱四齡若蟲進(jìn)行RNAi實(shí)驗(yàn),dsRNA濃度為0.5mg/ml,并連續(xù)喂食6和5天。qRT-PCR結(jié)果顯示,與空白
7、對(duì)照相比,灰飛虱和白背飛虱相應(yīng)的Halloween基因和蛻皮激素受體基因(EcR)在mRNA表達(dá)水平均顯著下降。RNAi引起若蟲死亡并延緩若蟲的發(fā)育;對(duì)白背飛虱和灰飛虱試蟲cyp307a1基因進(jìn)行dsRNA干擾后,微量點(diǎn)滴20-羥基蛻皮酮進(jìn)行補(bǔ)償實(shí)驗(yàn)。結(jié)果顯示,Sfcyp307a1和Lscyp307a1的表達(dá)水平?jīng)]有提高,但是幾乎完全恢復(fù)SfEcR和LsEcR mRNA的表達(dá)水平,并能補(bǔ)償RNAi對(duì)若蟲存活和發(fā)育帶來的負(fù)面影響。因此,本
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