桔小實蠅蛻皮激素合成和信號通路基因調(diào)控與功能研究.pdf

1、桔小實蠅Bactroceradorsalis(Hendel)隸屬于雙翅目Diptera，實蠅科Tephritidae，是一種在世界范圍內(nèi)廣泛分布的重要農(nóng)業(yè)害蟲。桔小實蠅成蟲產(chǎn)卵于果皮內(nèi)，幼蟲孵化后在果實內(nèi)取食危害，嚴重降低果實經(jīng)濟和食用價值;加之其成蟲寄主范圍廣、適應(yīng)性和繁殖力以及擴散能力強等特點，該蟲被許多國家列為檢疫對象，成為國際貿(mào)易的技術(shù)壁壘。與其他昆蟲一樣，桔小實蠅不能依賴自身物質(zhì)從頭合成蛻皮激素，只能是將其取食獲得的植物甾醇或

2、動物膽固醇進行一系列相應(yīng)的代謝而產(chǎn)生。負責該過程的是一類名為“Halloweengene”的P450多功能氧化酶，將植物甾醇最終氧化成為最具生物活性的20-羥基蛻皮酮(20E)，調(diào)控昆蟲胚胎發(fā)育、幼蟲生長與變態(tài)、蛹期形態(tài)建成以及成蟲交配繁殖等整個過程。合成的20E可誘導(dǎo)蛻皮激素受體EcR表達，當EcR達到一定閾值后，與其配體USP形成功能性的EcR/USP異二聚體。隨后，再與20E進行結(jié)合，形成20E-EcR/USP復(fù)合體，起始20E信

3、號傳遞，并介導(dǎo)產(chǎn)生一系列早期和晚期級聯(lián)反應(yīng)，最終影響細胞的增殖、分化，甚至程序性死亡。隨著RNAi技術(shù)的出現(xiàn)與成熟，基因功能的研究進入一個嶄新的階段。借助該技術(shù)，可以重新發(fā)現(xiàn)基因新功能、探索未知基因功能，是生物反應(yīng)、藥物篩選、疾病治療、害蟲防治等研究的有力手段，極大地加快了分子生物學研究步伐，具有廣闊的應(yīng)用前景。
　　本學位論文以柑桔重要害蟲桔小實蠅為研究對象，利用RT-PCR和RACE技術(shù)，克隆獲得桔小實蠅蛻皮激素合成和信號通路

4、基因全長序列，對其特征序列進行注釋并確定其系統(tǒng)發(fā)育關(guān)系;在此基礎(chǔ)上運用qPCR技術(shù)分析這些基因在桔小實蠅胚后發(fā)育各階段和幼蟲不同組織中的表達及分布情況;同時，結(jié)合生測試驗，明確幼蟲在饑餓脅迫條件下的生物學變化和上述基因轉(zhuǎn)錄水平情況，明確桔小實蠅的應(yīng)激響應(yīng)機制，為其綜合防治提供依據(jù)。昆蟲生長發(fā)育是受激素嚴格控制的過程，在農(nóng)業(yè)生產(chǎn)中常用激素類似物質(zhì)來干擾害蟲的正常生長，從而達到控害的目的。因此，本研究還利用微量注射技術(shù)，研究外源20E對桔小

5、實蠅幼蟲發(fā)育、變態(tài)及蛻皮激素合成和信號通路基因表達的影響。最后，利用RNAi技術(shù)明確桔小實蠅蛻皮激素受體BdEcR-B1在幼蟲階段的20E信號傳導(dǎo)中的作用。加深桔小實蠅變態(tài)發(fā)育的分子調(diào)節(jié)和作用機制的研究，尤其是對蛻皮激素合成和信號傳導(dǎo)通路對其發(fā)育變態(tài)的分子調(diào)控模式，及其在逆境脅迫條件下的應(yīng)激響應(yīng)機制，將有助于明確各基因在通路中的功能及其調(diào)節(jié)方式，為轉(zhuǎn)基因技術(shù)在害蟲控制中的應(yīng)用提供潛在作用靶標，同時為新型農(nóng)藥開發(fā)提供理論依據(jù)。本研究主要研

6、究結(jié)果如下:
　　1桔小實蠅蛻皮激素合成與信號通路基因克隆與序列分析
　　基于對桔小實蠅轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)分析的基礎(chǔ)上，利用RT-PCR和RACE技術(shù)，克隆獲得了桔小實蠅蛻皮激素合成和信號通路上7個基因的cDNA全長序列，并完成在GenBank登錄，其基因名稱和登錄號分別為BdCyp302a1(JQ027284)、BdCyp315a1(KC515377)、BdCyp314a1(JQ229645)、BdEcR-B1(JQ034623)

7、、BdE75(KC515378)、BdL63(KC515379)和BdTaiman(JQ266268)。利用分子生物學軟件對上述基因進行分析，明確其開放閱讀框ORF、氨基酸序列、理化性質(zhì)、跨膜結(jié)構(gòu)域等，并對其保守結(jié)構(gòu)域進行了鑒定和詳細注釋。分析發(fā)現(xiàn)，桔小實蠅蛻皮激素合成通路基因BdCyp302a1、BdCyp315a1和BdCyp314a1均屬于“Halloween”基因家族，具有細胞色素氧化酶P450所特有簽名序列:Helix-I、H

8、elix-K、底物識別性位點和血紅蛋白結(jié)合位點等結(jié)構(gòu)。桔小實蠅的BdCyp302a1和BdCyp314a1屬于線粒體型，而BdCyp315a1屬于微粒體細胞色素氧化酶。在蛻皮激素信號通路基因的研究中發(fā)現(xiàn)，桔小實蠅BdEcR-B1具有典型核受體保守結(jié)構(gòu)域和微結(jié)構(gòu)域，如DNA結(jié)合域和配體結(jié)構(gòu)域等結(jié)構(gòu)，雙翅目昆蟲EcR-B1亞型所特有的K/RRRW、S-rich、DL-rich、EESST/SEVV/TSS等特征基序。與BdEcR-B1相同，

9、BdE75同屬于核受體基因家族，具有其典型的配體結(jié)合域以及DNA結(jié)合域，其內(nèi)含量2個C4鋅指結(jié)構(gòu)，在蛻皮激素信號通路上起初級響應(yīng)元件的作用。BdL63序列N端具有cyclin-dependentkinase結(jié)構(gòu)。BdTaiman屬于p160核受體共激活子家族，具有basichelix-loop-helix(bHLH)結(jié)構(gòu)域及乙?；湫徒Y(jié)構(gòu)基序LxxLL。
　　2桔小實蠅蛻皮激素合成與信號通路基因的表達模式分析
　　2.1桔小

10、實蠅蛻皮激素合成與信號通路基因在不同發(fā)育階段的表達模式
　　在成功建立桔小實蠅蛻皮激素合成與信號通路基因的qPCR反應(yīng)體系的基礎(chǔ)上，以α-Tubulin為內(nèi)參基因，分別對桔小實蠅蛻皮激素合成通路（BdNvd、BdCyp306a1、BdCyp302a1、BdCyp315a1稚BdCyp314a1）和信號通路(BdEcR-B1、BdUSP、BdE75、BdL63、BdTaiman)基因在其不同發(fā)育階段（幼蟲、蛹和雌成蟲），共25個時間

11、點的表達情況進行了分析。
　　桔小實蠅蛻皮激素合成通路基因在不同日齡幼蟲中的表達模式較為相似，BdNvd、BdCyp302a1、BdCyp314a1基因的最高表達量均出現(xiàn)在末齡幼蟲階段，與即將出現(xiàn)的化蛹行為有關(guān)。在蛹期，與BdNvd在蛹末期高表達不同，BdCyp306a1、BdCyp302a1和BdCyp315a1基因相對最高表達量出現(xiàn)在化蛹初期，并隨著蛹日齡的增加而顯著地降低;BdCyp314a1則在蛹期呈現(xiàn)3個表達高峰，可能與

12、20E介導(dǎo)的組織重建過程相關(guān)。在成蟲期，除BdCyp314a1外，桔小實蠅蛻皮激素合成通路基因的最低表達量均出現(xiàn)在羽化初期，在第7日齡中出現(xiàn)顯著性升高，并隨即下降后再次上升，并在第19日齡成蟲中達到相對表達量的最大值，表明蛻皮激素合成通路基因的表達與其性成熟和產(chǎn)卵行為有關(guān)。
　　就蛻皮激素信號通路基因而言，BdEcR-B1、BdUSP、BdL63和BdTaiman的表達量在末齡幼蟲階段均出現(xiàn)上升，暗示這些基因可能與蛻皮激素介導(dǎo)的變

13、態(tài)反應(yīng)有關(guān)。BdE75在蛹中期特異性高表達，可能在組織重建中具有重要作用。其余基因在蛹中后期表達模式比較相似，呈現(xiàn)逐漸下降的趨勢，暗示由20E調(diào)控的組織重建過程也趨于完成。在成蟲期，BdEcR-B1和BdE75基因的相對表達量隨日齡的增加而出現(xiàn)上升;BdUSP和BdL63基因的相對表達量在前16日中保持相對穩(wěn)定，在第19日齡出現(xiàn)明顯的上升;而BdTaiman基因的相對最高表達量出現(xiàn)在雌蟲羽化的第1天，并在隨后的階段保持相對穩(wěn)定，推測上述

14、基因在雌蟲卵巢成熟過程中起不同作用。
　　2.2桔小實蠅蛻皮激素合成與信號通路基因在不同組織的表達模式
　　同樣以α-Tubulin為內(nèi)參基因，對上述基因在桔小實蠅5日齡幼蟲前胸腺（復(fù)合體）、脂肪體、中腸、馬氏管、表皮和氣管的mRNA的表達水平進行了評價。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，前胸腺仍為蛻皮激素早期合成的主要場所。BdNvd、BdCyp306a1和BdCyp315a1基因在前胸腺中特異性高表達，極顯著高于脂肪體、中腸、馬氏管、表皮和氣管

15、，而這些組織內(nèi)的表達量無顯著性差異。BdCyp302a1基因在脂肪體、前胸腺、馬氏管/表皮、中腸/氣管中的表達量逐步降低。而BdCyp314a1基因在中腸、馬氏管、脂肪體中的相對表達量依次降低，但均顯著性高于表皮、氣管和前胸腺。說明桔小實蠅不同組織均參與蛻皮激素的合成，前胸腺、脂肪體和中腸是20E合成的主要場所;此外，馬氏管除主要負責排泄外，也參與了蛻皮激素的合成。
　　在桔小實蠅蛻皮激素信號通路基因的研究中發(fā)現(xiàn)，BdEcR-B1

16、和BdE75的表達模式較為相似，在脂肪體的表達量極顯著高于其余5個組織，且在5個組織內(nèi)無顯著性差異;其中，BdE75在脂肪體內(nèi)特異性高表達，其表達量是表皮的122倍。BdUSP在前胸腺表達量與脂肪體無顯著性差異，但均極顯著高于其他4個組織。而BdL63的表達量在脂肪體、前胸腺和馬氏管中依次降低，而在馬氏管、中腸和表皮中無顯著性差異。BdTaiman基因在馬氏管中的表達量顯著性高于表皮，但與前胸腺、脂肪體和中腸差異不顯著。綜上，蛻皮激素信

17、號通路基因主要集中在脂肪體內(nèi)表達，由此推測，這可能與脂肪體營養(yǎng)儲存和能量代謝功能相關(guān)。
　　3饑餓對桔小實蠅幼蟲發(fā)育和蛻皮激素合成與信號通路基因的影響
　　3.1饑餓對桔小實蠅幼蟲發(fā)育的影響
　　對桔小實蠅5日齡幼蟲進行不同時長饑餓處理后發(fā)現(xiàn)，饑餓有效縮短幼蟲歷期，造成提前化蛹，且蛹體較小的現(xiàn)象，但并未引起幼蟲存活率的降低，說明桔小實蠅在末齡幼蟲的第1天，已經(jīng)達到其化蛹所需最低體重閾值;在食物不足的情況下，通過提前變態(tài)

18、成小個體蛹，來避免外界不利環(huán)境對自身的影響，維持種群延續(xù)。
　　3.2桔小實蠅蛻皮激素合成信號通路基因在饑餓脅迫下的表達模式
　　利用實時定量熒光PCR檢測發(fā)現(xiàn)，其蛻皮激素合成通路基因表達水平在饑餓處理后出現(xiàn)明顯的變化。BdNvd、BdCyp302a1和BdCyp314a1基因的相對表達量在饑餓脅迫6h后即出現(xiàn)顯著性上調(diào)，其中BdCyp302a1和BdCyp314a1基因在24h達到極顯著上調(diào)水平;而饑餓后48h后，BdNv

19、d、BdCyp302a1和BdCyp314a1的表達水平出現(xiàn)顯著性降低。對信號通路基因的研究發(fā)現(xiàn)，除BdL63外，其余各基因表達均出現(xiàn)顯著性上調(diào)。由此推測，桔小實蠅幼蟲在食物缺乏的狀況下，可能通過提高蛻皮激素合成和信號通路基因的轉(zhuǎn)錄水平使體內(nèi)蛻皮激素含量升高，信號傳導(dǎo)加強，導(dǎo)致其幼蟲提前化蛹，從而避免不良環(huán)境的脅迫。
　　4外源20E對桔小實蠅幼蟲發(fā)育和蛻皮激素合成與信號通路基因的影響
　　4.1外源20E對桔小實蠅幼蟲發(fā)育

20、的影響
　　利用微量注射法，觀察不同劑量20E處理對桔小實蠅幼蟲發(fā)育的影響。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，注射激素后，幼蟲化蛹時間提前。同時，化蛹過程出現(xiàn)異常，并出現(xiàn)頭部縊縮、黑化以及幼蟲形態(tài)蛹的現(xiàn)象，且畸形的蛹寬和蛹長出現(xiàn)變化。畸形率和蛹死亡率顯著上升。說明外源激素干擾了桔小實蠅幼蟲正常生長發(fā)育和變態(tài)過程。
　　4.2外源20E對桔小實蠅蛻皮激素合成與信號通路基因的影響
　　經(jīng)0.1μg/頭劑量處理后，桔小實蠅蛻皮激素合成通路基因BdN

21、vd、BdCyp306a1、BdCyp302a1和BdCyp315a1均表現(xiàn)出相似的誘導(dǎo)反應(yīng)，其相對表達量出現(xiàn)極顯著上調(diào)，而BdCyp314a1的表達卻被外源激素所抑制。桔小實蠅蛻皮激素信號通路基因的表達也表現(xiàn)出類似的誘導(dǎo)效應(yīng)。除BdEcR-B1僅在處理1h后出現(xiàn)極顯著的下調(diào)外，其它基因較對照而言，均出現(xiàn)極顯著的上調(diào)。
　　經(jīng)0.1和1.0μg/頭外源20E處理后，BdNvd、BdCyp306a1和BdCyp315a1的表達量均極

22、顯著高于對照組;BdCyp302a1的表達量僅在0.1μg/頭的劑量處理下極顯著性高于對照組;而BdCyp314a1的表達量在0.5和1.0μg/頭處理組的表達量均顯著性低于對照。此外，BdEcR-B1和BdUSP均出現(xiàn)極顯著上調(diào)。BdE75和BdL63對20E處理的反應(yīng)較為一致，均在0.1μg和1.0μg/頭處理后出現(xiàn)極顯著性的上調(diào)。但0.5μg/頭處理對蛻皮激素合成和信號通路基因的表達均表現(xiàn)出不同程度的抑制作用，該劑量可能是桔小實蠅

23、體內(nèi)某些生理反應(yīng)的一個閾值，影響其生長發(fā)育等重要過程。
　　5桔小實蠅BdEcR-B1基因的功能研究
　　通過體外轉(zhuǎn)錄法獲得高質(zhì)量dsRNA，借助微量注射技術(shù)將外源dsRNA導(dǎo)入桔小實蠅5日齡幼蟲體內(nèi)。qPCR分析結(jié)果表明，BdEcR-B1基因表達量在注射72h后出現(xiàn)明顯的下調(diào)，其表達量僅為對照組的53.4％。對桔小實蠅蛻皮激素信號通路基因的相對表達量進行分析發(fā)現(xiàn)，在靶基因沉默后，BdUSP和BdTaiman基因相對表達量出

24、現(xiàn)了顯著性下調(diào)，其中BdTaiman基因相對表達量在注射24-72h后出現(xiàn)極顯著的下調(diào)，僅為對照組的9.7-12.5％。而BdE75基因和BdL63基因的轉(zhuǎn)錄并未受影響，出現(xiàn)2倍左右的上調(diào)。說明BdEcR-B1在蛻皮激素信號傳導(dǎo)中直接調(diào)控其配體和共激活子的表達。
　　綜上所述，本研究通過高通量測序、RT-PCR和RACE技術(shù)，分離克隆獲得桔小實蠅蛻皮激素合成和信號通路基因cDNA全長序列，借助qPCR手段分析其在不同發(fā)育階段、不同