桔小實(shí)蠅胰島素信號通路六個重要基因的表達(dá)與功能研究.pdf

1、桔小實(shí)蠅Bactrocera dorsalis(Hendel)隸屬雙翅目Diptera、實(shí)蠅科Tephritidae，廣泛分布于熱帶和亞熱帶地區(qū)。桔小實(shí)蠅寄主范圍廣、適應(yīng)性、繁殖力以及擴(kuò)散能力強(qiáng)，是一種重要的果蔬害蟲。該蟲成蟲產(chǎn)卵于果實(shí)內(nèi)，孵化后的幼蟲通過潛居果瓤取食進(jìn)行危害，造成果實(shí)腐爛、未熟先落，使果蔬的經(jīng)濟(jì)價值和食用價值大幅度降低。桔小實(shí)蠅的防治經(jīng)歷了一個從誘集防治到化學(xué)防治的過程，目前，由于大量不合理地使用化學(xué)殺蟲劑，造成了桔小

2、實(shí)蠅對多種常用殺蟲劑產(chǎn)生了嚴(yán)重的抗藥性。昆蟲胰島素信號的轉(zhuǎn)導(dǎo)可以調(diào)節(jié)機(jī)體的生長發(fā)育、代謝、生殖以及衰老等重要生理過程。因此，闡明桔小實(shí)蠅胰島素信號通路調(diào)控其變態(tài)發(fā)育的分子機(jī)制，可為尋找殺蟲劑新的作用靶標(biāo)提供理論基礎(chǔ)。
　　本學(xué)位論文基于桔小實(shí)蠅轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)庫信息，運(yùn)用RT-PCR結(jié)合RACE技術(shù)，從桔小實(shí)蠅體內(nèi)克隆獲得了6個胰島素信號通路基因的cDNA序列，并對其特征序列進(jìn)行注釋，利用qPCR技術(shù)解析了6個基因在桔小實(shí)蠅不同發(fā)育階段

3、、不同組織的表達(dá)特性，以及饑餓脅迫和激素處理后基因的應(yīng)激表達(dá)模式;最后利用RNAi技術(shù)探索了胰島素受體底物蛋白（Insulin receptor substrate）基因IRS在桔小實(shí)蠅卵巢發(fā)育中的作用。研究結(jié)果將有助于探索桔小實(shí)蠅胰島素信號通路基因的功能及其調(diào)控機(jī)制，為桔小實(shí)蠅的持續(xù)防控提供新的思路和方法。主要研究結(jié)果如下:
　　1、桔小實(shí)蠅胰島素信號通路6個重要基因的克隆與序列分析
　　根據(jù)從桔小實(shí)蠅轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)庫篩選鑒定

4、的unigene序列，克隆獲得了桔小實(shí)蠅胰島素信號通路6個重要基因的cDNA序列，分別為胰島素受體(Insulin receptor，InR);胰島素受體底物蛋白（Insulin receptor substrate，IRS）;磷脂酰肌-3-激酶(Phosphotidylinositol3 kinase，PI3K)—PI3K92E和PI3K21B;蛋白激酶B(ProteinKinase B，Akt/PKB);磷酸肌醇依賴性激酶(Phos

5、phoinositide-dependent kinase，PDK)。GenBank登錄號分別為KJ028005、KF305824、KJ028006、KJ011126、KJ011125和KJ011127。通過序列分析，明確了4個基因的開放閱讀框，并推導(dǎo)了其編碼的氨基酸序列。進(jìn)一步利用Scanprosite、NetNGlyc1.0、SignalP4.1以及TMHMM等生物信息學(xué)軟件分析了6個基因推導(dǎo)的蛋白質(zhì)的保守序列、跨膜結(jié)構(gòu)、信號肽序列

6、等潛在的生理功能。
　　2、桔小實(shí)蠅胰島素信號通路6個重要基因的表達(dá)模式分析
　　2.1桔小實(shí)蠅胰島素信號通路6個重要基因在不同發(fā)育階段的表達(dá)模式
　　利用qPCR技術(shù)解析了胰島素信號通路6個重要基因在桔小實(shí)蠅幼蟲、蛹和成蟲期的mRNA表達(dá)模式。結(jié)果表明，桔小實(shí)蠅胰島素信號通路6個基因在幼蟲-蛹和蛹末期的表達(dá)變化明顯，其中InR、Akt/PKB和PDK主要在幼蟲-蛹的轉(zhuǎn)化過程中表達(dá)，而IRS、PI3 K21B和PI31

7、92E在這一階段表達(dá)量相對較低;所有胰島素信號通路基因的mRNA水平在蛹后期均出現(xiàn)了明顯的上調(diào)，推測胰島素信號通路在桔小實(shí)蠅變態(tài)發(fā)育的過程中起著重要作用。同時，桔小實(shí)蠅胰島素信號通路6個基因的表達(dá)具有明顯的性別差異。除IRS在雄蟲第7日齡的表達(dá)量明顯高于雌蟲外，其它基因均為雌蟲的表達(dá)量高于同一日齡的雄蟲，其中PI3K21B和InR在10日齡雌蟲的表達(dá)量顯著高于雄蟲，Akt/PKB在4日齡的雌蟲中的表達(dá)量明顯高于雄蟲。
　　2.2桔

8、小實(shí)蠅胰島素信號通路6個重要基因在不同組織的表達(dá)模式
　　利用qPCR和RT-PCR技術(shù)解析了胰島素信號通路6個基因在桔小實(shí)蠅3齡幼蟲的腦、脂肪體、馬氏管、中腸、氣管和表皮組織，以及成蟲的頭部、胸部、脂肪體、馬氏管和中腸的表達(dá)模式。結(jié)果表明，6個基因均在桔小實(shí)蠅幼蟲的腦部和成蟲的頭部出現(xiàn)了高水平表達(dá);而IRS、PI3 K21B、PI3K92E和PDK也在幼蟲馬氏管和脂肪體高表達(dá)。推測胰島素信號通路可能參與了腦部的神經(jīng)分泌系統(tǒng)，并在

9、信號傳遞中發(fā)揮著重要作用，而脂肪體是營養(yǎng)儲存和能量代謝的主要器官。
　　3、外源激素和饑餓對桔小實(shí)蠅胰島素信號通路6個重要基因表達(dá)的影響
　　3.1外源激素對桔小實(shí)蠅胰島素信號通路6個重要基因表達(dá)的影響
　　將桔小實(shí)蠅3齡幼蟲的脂肪體進(jìn)行外源激素20E和JHA的處理。結(jié)果表明，兩種激素處理12h后，IRS、PI3 K21B、Akt/PKB和PDK的表達(dá)量都出現(xiàn)了不同程度的上調(diào)，而PI3K92E的表達(dá)量在JHA處理后出現(xiàn)

10、了顯著下調(diào);與其它基因不同，InR在兩種激素處理后其表達(dá)量沒有發(fā)生明顯的變化。由此推測，桔小實(shí)蠅在外源激素的刺激下，可能通過提高部分胰島素信號通路基因的轉(zhuǎn)錄水平使體內(nèi)各激素達(dá)到動態(tài)平衡。
　　3.2饑餓對桔小實(shí)蠅胰島素信號通路6個重要基因表達(dá)的影響
　　利用qPCR技術(shù)解析了桔小實(shí)蠅胰島素信號通路6個基因在饑餓處理后表達(dá)量的變化。結(jié)果表明，除PI3K21B外，其余5個基因的表達(dá)水平在饑餓處理后明顯上調(diào)。重新飼喂已饑餓處理的幼

11、蟲，這些基因的mRNA表達(dá)相對于持續(xù)饑餓的幼蟲又出現(xiàn)下調(diào)。推測這可能昆蟲的是一種應(yīng)激機(jī)制，由此調(diào)整自身激素代謝平衡。
　　4、桔小實(shí)蠅IRS基因的功能研究
　　利用顯微注射將體外合成的dsRNA導(dǎo)入桔小實(shí)蠅雌蟲體內(nèi)，并通過qPCR技術(shù)檢測目的基因的沉默效果。結(jié)果表明，對桔小實(shí)蠅雌蟲的IRS基因進(jìn)行RNA干擾后，其mRNA表達(dá)水平明顯下降，且雌蟲卵巢的直徑明顯小于對照。另外，干擾24 h和48 h后IRS的表達(dá)受到抑制時，通路