桔小實蠅雌性特異胚胎致死品系的構(gòu)建.pdf

1、昆蟲不育技術(shù)(Sterile insect technique，SIT)是根除實蠅類害蟲和預(yù)防害蟲在高風(fēng)險地區(qū)定殖的最有效的防治方法。本研究以世界性農(nóng)業(yè)害蟲桔小實蠅Bactrocera dorsalis(Hendel)為對象，通過分離、鑒定桔小實蠅雌性特異胚胎致死的遺傳性別品系特異調(diào)控元件，構(gòu)建桔小實蠅雌性特異胚胎致死驅(qū)動載體和效應(yīng)載體，建立桔小實蠅遺傳轉(zhuǎn)化技術(shù)，以期獲得桔小實蠅雌性特異胚胎致死品系，實現(xiàn)在桔小實蠅飼養(yǎng)階段清除所有雌蟲，

2、為不育雄蟲釋放的昆蟲不育技術(shù)項目提供技術(shù)支撐。主要研究結(jié)果如下:
　　(1)利用實時熒光定量PCR分析Bdvasa的時空表達譜，反向PCR分離Bdvasa5'側(cè)翼的上游啟動子序列，結(jié)果表明Bdvasa是一種在胚胎早期高水平表達的母體效應(yīng)基因，分離得到Bdvasa翻譯起始密碼子上游1996 bp序列，成功用于構(gòu)建驅(qū)動tTA表達的驅(qū)動載體2個。
　　(2)為分離候選的桔小實蠅顯性致死基因，通過同源基因克隆和RACE技術(shù)克隆桔小實

3、蠅細胞凋亡效應(yīng)酶caspase-1，實時熒光定量PCR分析該基因的時空表達譜，腹部RNAi研究該基因在雌蟲生殖過程中的功能，結(jié)果為:克隆得到桔小實蠅細胞凋亡效應(yīng)酶caspase-1的cDNA全長1679 bp，編碼328個氨基酸殘基，并將該基因命名為Bdcp-1; Bdcp-1在桔小實蠅的不同發(fā)育時期和成蟲的不同組織間均有表達，其表達量與桔小實蠅生長發(fā)育過程密切相關(guān);適量的UV照射可以提高Bdcp-1 mRNA轉(zhuǎn)錄水平，Bdcp-1在U

4、V照射1h的8日齡蛹中的表達量是未照射的5.6倍，照射1.5 h是未照射的5.2倍，暗示細胞通過caspase級聯(lián)反應(yīng)調(diào)控受損細胞凋亡，維持細胞正常的生命活動，但照射超過2h后，這種凋亡機制被破壞;Bdcp-1在雌蟲生殖過程中具有重要作用，該基因沉默后，卵巢發(fā)育和卵黃蛋白基因Bdyp1的表達受到抑制，產(chǎn)卵前期延長，單頭雌蟲累計產(chǎn)卵量顯著降低。
　　(3)為了分離桔小實蠅性別特異剪接調(diào)控元件，利用PCR結(jié)合RACE技術(shù)分析桔小實蠅B

5、dtra和Bdtra-2的基因組和cDNA結(jié)構(gòu)，半定量PT-PCR研究這2個基因的表達模式，胚胎RNAi研究這2個基因的功能。結(jié)果為:桔小實蠅Bdtra存在1個雌性特異剪接體和2個雄性特異剪接體，Bdtra-2不存在性別特異剪接;Bdtra雌性特異剪接體和Bdtra-2基因具有母體遺傳表達特性，Bdtra雄性特異剪接體在產(chǎn)后1h后的胚胎中才能檢測到;胚胎RNAi Bdtra或Bdtra-2均能高效誘導(dǎo)雌性胚胎發(fā)育為表型雄蟲，證明Bdtr