桔小實(shí)蠅肽聚糖識(shí)別蛋白基因鑒定與功能分析.pdf

1、先天免疫系統(tǒng)是昆蟲抵御病原物入侵的主要防御系統(tǒng)，昆蟲先天免疫包括體液免疫和細(xì)胞免疫。體液免疫主要以產(chǎn)生抗菌肽、凝集素、溶菌酶和蛋白酶抑制劑等方式發(fā)揮作用，而細(xì)胞免疫則是通過細(xì)胞吞噬和包被發(fā)揮作用。昆蟲先天免疫系統(tǒng)主要依賴Toll和Imd兩個(gè)信號(hào)通路行使功能。Toll信號(hào)通路主要參與對(duì)革蘭氏陽性細(xì)菌的免疫過程，而Imd則主要參與對(duì)革蘭氏陰性細(xì)菌的免疫過程。肽聚糖識(shí)別蛋白（Peptidoglycan Recognition Proteins

2、,PGRPs）在這兩個(gè)免疫通路中有著至關(guān)重要的作用，是昆蟲免疫系統(tǒng)中的第一道防線。對(duì)PGRPs的研究有助于進(jìn)一步了解昆蟲的免疫反應(yīng)過程，能夠?yàn)榛诿庖咝盘?hào)通路的害蟲防控技術(shù)的研究提供基礎(chǔ)數(shù)據(jù)。
　　本學(xué)位論文以果蔬重要害蟲桔小實(shí)蠅（Bactrocera dorsalis）為研究對(duì)象，利用基因組和轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)庫對(duì)桔小實(shí)蠅PGRPs進(jìn)行全面挖掘和鑒定；利用熒光定量PCR技術(shù)，分析PGRPs在桔小實(shí)蠅不同發(fā)育階段的表達(dá)模式；采用顯微注射和

3、RT-qPCR技術(shù)，檢測(cè)病原物誘導(dǎo)后PGRPs的表達(dá)變化；最后利用RNAi技術(shù)，干擾PGRP-LC并測(cè)定桔小實(shí)蠅對(duì)細(xì)菌敏感性的變化，初步發(fā)現(xiàn)了PGRP-LC在桔小實(shí)蠅免疫中的功能。本研究旨在為深入開展桔小實(shí)蠅PGRPs研究奠定基礎(chǔ)。主要研究結(jié)果如下：
　　1.桔小實(shí)蠅PGRPs的鑒定與序列分析
　　基于桔小實(shí)蠅基因數(shù)據(jù)庫和轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)，鑒定了12個(gè)桔小實(shí)蠅PGRPs。其中，有5條PGRPs基因存在可變剪切現(xiàn)象，PGRP-LA、

4、PGRP-LB、PGRP-LC、PGRP-LD、PGRP-SC分別有2個(gè)、2個(gè)、4個(gè)、3個(gè)和2個(gè)剪切子。尤以PGRP-LC的剪切方式最為復(fù)雜。系統(tǒng)發(fā)育分析結(jié)果發(fā)現(xiàn)，桔小實(shí)蠅PGRPs與橄欖實(shí)蠅和地中海實(shí)蠅PGRPs親緣關(guān)系最近。對(duì)桔小實(shí)蠅PGRPs功能域C端氨基酸比對(duì)，發(fā)現(xiàn)多個(gè)保守的氨基酸殘基，推測(cè)PGRP-LB、-SB1/2、-SC2、-SC2b、-NSB1和-SC等都具有酰胺酶活性；除PGRP-SA、PGRP-SCb和PGRP-NS

5、C2外，其它PGRPs均含有Arg位點(diǎn)，可能參與對(duì)二氨基庚二酸型肽聚糖（Pepridoglycan from Gram-negative bacteria,DAP-PGN）的識(shí)別。
　　2.桔小實(shí)蠅PGRPs不同發(fā)育階段的表達(dá)模式
　　桔小實(shí)蠅PGRPs在不同發(fā)育階段的mRNA表達(dá)水平存在差異，表明在桔小實(shí)蠅生長過程中發(fā)揮的功能不同。其中，PGRP-LA、PGRP-LB和PGRP-LC在桔小實(shí)蠅整個(gè)變態(tài)過程中均高量表達(dá)，而P

6、GRP-LE、PGRP-SB1/2和PGRP-SC2/2b均在幼蟲期和成蟲期高表達(dá)。結(jié)合對(duì)果蠅PGRP-SC2的研究結(jié)果，推測(cè)桔小實(shí)蠅PGRP-SC2和PGRP-SC2b可能對(duì)腸道微生物具有調(diào)控作用。PGRP-SA在桔小實(shí)蠅各個(gè)發(fā)育階段均有表達(dá)， PGRP-SD主要在成蟲期高表達(dá)，而PGRP-SCa的表達(dá)無明顯規(guī)律。
　　3.桔小實(shí)蠅PGRPs在病原因子誘導(dǎo)后的表達(dá)變化
　　利用顯微注射和熒光定量PCR技術(shù)，分析桔小實(shí)蠅PG

7、RPs在 E.coli、PGN-EB（Pepridoglycan from E.coli O111:B4）和PGN-SA（Pepridoglycan from Staphylococcus aureus）誘導(dǎo)后表達(dá)變化。結(jié)果顯示，在注射E.coli和PGN-EB后，PGRP-LAa、PGRP-LB、PGRP-SC2和PGRP-SC2b表達(dá)受到抑制，推測(cè)這些基因在桔小實(shí)蠅體內(nèi)可能是Imd信號(hào)通路的負(fù)調(diào)控因子；而PGRP-LE表達(dá)上調(diào)，推測(cè)

8、PGRP-LE可能參與對(duì)革蘭氏陰性細(xì)菌的識(shí)別。在注射PGN-SA后，PGRP-LE的表達(dá)受到抑制，推測(cè)PGRP-LE可能不參與對(duì)PGN-SA的識(shí)別。PGRP-SA、PGRP-SD、PGRP-SB1和PGRP-SB2的表達(dá)在注射病原物誘導(dǎo)后均上調(diào)，說明它們可能參與到對(duì)兩類細(xì)菌的識(shí)別過程。
　　4.桔小實(shí)蠅PGRP-LC的功能分析
　　采用熒光定量PCR技術(shù)分析桔小實(shí)蠅PGRP-LC的4個(gè)剪切子在不同組織中表達(dá)模式，結(jié)果發(fā)現(xiàn)這4

9、個(gè)剪切子主要在成蟲中腸和脂肪體高水平表達(dá)。飼喂抗生素后，桔小實(shí)蠅PGRP-LCa、PGRP-LCb和PGRP-LCc的表達(dá)量發(fā)生顯著變化，其中PGRP-LCa表達(dá)顯著下調(diào)，PGRP-LCb和PGRP-LCc的表達(dá)則顯著上調(diào)，PGRP-LCd的表達(dá)沒發(fā)生顯著變化。4個(gè)剪切子均在E.coli和PGN-EB誘導(dǎo)后顯著上調(diào)，尤其以PGRP-LCd上調(diào)的倍數(shù)最高。在白僵菌誘導(dǎo)后，PGRP-LCc和PGRP-LCd顯著下調(diào)；在PGN-SA誘導(dǎo)后，P

10、GRP-LCb和PGRP-LCd顯著下調(diào)。不同的剪切子表達(dá)量的變化說明各自參與的免疫過程存在差異，其中PGRP-LCa參與的免疫過程更廣泛，PGRP-LCd的免疫特異性更強(qiáng)。在對(duì)3條剪切子基因有效干擾后，再注射E.coli后分析桔小實(shí)蠅的存活率，結(jié)果顯示注射桔小實(shí)蠅實(shí)蠅的存活率明顯下降，說明降低PGRP-LCa、PGRP-LCc和PGRP-LCd的表達(dá)，增加了桔小實(shí)蠅對(duì)E.coli的敏感性。同時(shí)降低3個(gè)剪切子的表達(dá)，使得桔小實(shí)蠅對(duì)E.c