桔小實蠅幾丁質(zhì)合成通路上3個基因的cDNA克隆及功能分析.pdf

1、桔小實蠅Bactrocera dorsalis(Hendel)隸屬于雙翅目(Diptera)，實蠅科(Tetrphitidae)，果實蠅屬（Bactrocera macpuart），寄主范圍廣，是為害多種水果和蔬菜的世界性害蟲。自傳入我國以來，迅速擴散至廣東、廣西、臺灣等沿海地區(qū)，近年來自南向北繼續(xù)擴散至江蘇、浙江、湖北等省市。桔小實蠅主要通過幼蟲在果實內(nèi)部危害，導(dǎo)致瓜果腐爛、脫落，而造成巨大的經(jīng)濟損失。這種特殊的危害方式導(dǎo)致幼蟲的危害

2、在早期難以被發(fā)現(xiàn)，而傳統(tǒng)的化學(xué)防治也難以達(dá)到防控的目的。昆蟲生長調(diào)節(jié)劑以其環(huán)保且對人畜無害等優(yōu)點成為研究的熱點，它的作用靶標(biāo)較多，幾丁質(zhì)就是其中之一。幾丁質(zhì)廣泛存在于節(jié)肢動物、線蟲、酵母等非哺乳動物體內(nèi)，由于其存在的特殊性而引起研究者們的廣泛興趣——作為害蟲防治的靶標(biāo)研發(fā)新型環(huán)保農(nóng)藥等生物制劑，從而達(dá)到田間防控害蟲的目的。幾丁質(zhì)的合成是一個復(fù)雜的過程，至少需要8種酶的共同參與，其中某一個過程受阻就會導(dǎo)致幾丁質(zhì)的合成受阻，導(dǎo)致昆蟲因缺少幾

3、丁質(zhì)而不能存活。本學(xué)位論文針對參與幾丁質(zhì)合成通路上的3個重要的酶（幾丁質(zhì)合成酶2，Chitin synthase2;葡萄糖-6-磷酸異構(gòu)酶，Glucose-6-phosphate isomerase;UDP-N-乙酰葡糖胺焦磷酸化酶，UDP-N-acetylglucosamine pyrophosphorylase），通過分子克隆，定量表達(dá)，饑餓飼喂，幾丁質(zhì)含量測定，抑制劑生物測定等方法，對桔小實蠅這3個基因的分子生物學(xué)特性進(jìn)行了初步的

4、研究，主要結(jié)果如下:
　　 1.桔小實蠅幾丁質(zhì)合成通路上BdCHS2、BdG6PI和BdUAP基因的cDNA全長克隆及序列分析
　　 從本實驗室測序獲得的桔小實蠅轉(zhuǎn)錄組中獲取相應(yīng)的Unigene片段，通過Overlapping技術(shù)獲得cDNA大片段，然后結(jié)合cDNA末端快速擴增(rapid amplification of cDNA ends，RACE)技術(shù)，成功地從桔小實蠅體內(nèi)分離克隆獲得3個幾丁質(zhì)合成通路上的基因Bd

5、CHS2、BdG6PI和BdUAP的cDNA全長序列，GenBank登錄號分別為KC354694、JQ925874及JX434756。通過序列分析，明確了這3個通路基因的開放閱讀框，并推導(dǎo)了其編碼的氨基酸序列。進(jìn)一步利用相應(yīng)的軟件預(yù)測蛋白質(zhì)的理化性質(zhì)、保守基序、跨膜結(jié)構(gòu)等生理功能。另外，從NCBI上下載其他物種相應(yīng)基因的cDNA序列，借助Mega5.04軟件并應(yīng)用Neighbor Joining方法構(gòu)建相對應(yīng)的系統(tǒng)發(fā)育樹，進(jìn)一步明確與其

6、他物種之間的遺傳距離。該研究結(jié)果豐富和發(fā)展了桔小實蠅幾丁質(zhì)合成通路基因的遺傳信息，為深入探討幾丁質(zhì)合成機制提供了基礎(chǔ)數(shù)據(jù)。
　　 2.桔小實蠅幾丁質(zhì)合成通路上BdCHS2、BdG6PI和BdUAP基因的時空表達(dá)分析
　　 分別解剖桔小實蠅7日齡幼蟲5種組織器官（表皮、氣管、中腸、脂肪體和馬氏管），然后提取總RNA及合成第一條cDNA鏈，借助qPCR(Real-time Quantitative PCR)儀，檢測桔小實蠅B

7、dCHS2、BdG6PI和BdUAP這3個基因在不同組織部位的表達(dá)模式。結(jié)果發(fā)現(xiàn)BdCHS2基因在中腸的表達(dá)顯著高于其他4個組織;BdG6PI基因主要分布于脂肪體和馬氏管中;BdUAP主要分布在表皮、馬氏管和中腸中;BdCHS2、BdG6PI和BdUAP在氣管中表達(dá)量均低。不同組織器官的定量表達(dá)，豐富了對這3個基因的認(rèn)識。
　　 分別收集獲得卵、幼蟲、蛹和成蟲（卵、1-8日齡幼蟲、1-10日齡蛹以及新羽化的成蟲）等4個蟲態(tài)的桔小

8、實蠅，然后提取總RNA及合成第一鏈cDNA，通過qPCR檢測幾丁質(zhì)合成通路上BdCHS2、BdG6PI和BdUAP基因在不同發(fā)育階段的表達(dá)模式。結(jié)果顯示桔小實蠅BdCHS2、BdG6PI和BdUAP基因在整個發(fā)育階段均有所表達(dá)，尤其在幼蟲和成蟲期的表達(dá)量高于卵期和蛹期，且不同基因在不同發(fā)育階段的表達(dá)量存在差異。研究結(jié)果明確了這3個基因在各個時期的表達(dá)情況，為后續(xù)基因功能的驗證實驗提供了前提條件。
　　 3.桔小實蠅饑餓及飼喂后幾

9、丁質(zhì)合成通路上BdCHS2、BdG6PI和BdUAP基因定量表達(dá)分析
　　 為進(jìn)一步明確饑餓對桔小實蠅幼蟲的影響，實驗分別設(shè)置饑餓和飼喂處理24h后，饑餓處理的幼蟲再飼喂24h，飼喂處理的幼蟲再饑餓24h，期間解剖中腸并提取總RNA及合成第一鏈，通過qPCR技術(shù)檢測桔小實蠅幼蟲經(jīng)過饑餓-飼喂處理后BdCHS2、BdG6PI和BdUAP這3個基因在中腸的表達(dá)模式。結(jié)果顯示，桔小實蠅經(jīng)饑餓后再飼喂，BdCHS2基因的表達(dá)量比飼喂后再

10、饑餓的高，饑餓-飼喂對該基因影響比較明顯;桔小實蠅饑餓后再飼喂，BdG6PI基因的表達(dá)量也高于飼喂后再饑餓的處理，而饑餓-飼喂對桔小實蠅幼蟲中腸BdUAP基因表達(dá)量的影響不顯著。該研究結(jié)果證實了饑餓能夠影響桔小實蠅BdCHS2和BdG6PI基因的表達(dá)，而對BdUAP基因的表達(dá)影響較低。
　　 4.除蟲脲對桔小實蠅幼蟲的影響
　　 挑取桔小實蠅孵化后1日齡幼蟲，采用浸漬法進(jìn)行除蟲脲的生物測定。不同濃度除蟲脲處理桔小實蠅48

11、h后檢測結(jié)果，求得除蟲脲對桔小實蠅1日齡幼蟲的致死中濃度(LC50)為42.05mg/L，且幼蟲出現(xiàn)不能蛻皮而死亡的表現(xiàn)型;qPCR檢測發(fā)現(xiàn)低劑量的除蟲脲對BdCHS2基因沒有顯著性影響。
　　 5.幾丁質(zhì)含量測定
　　 通過對桔小實蠅幼蟲饑餓-飼喂處理，測定單頭試蟲中腸幾丁質(zhì)含量。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，饑餓及飼喂處理對桔小實蠅幾丁質(zhì)含量影響顯著，且與定量表達(dá)結(jié)果一致，驗證了BdCHS2基因在中腸高表達(dá)這一結(jié)果。通過測定桔小實蠅不同

12、發(fā)育階段的幾丁質(zhì)含量，發(fā)現(xiàn)在卵期至幼蟲階段，其幾丁質(zhì)含量呈幾何乘冪形式增長，蛹前期幾丁質(zhì)含量較低，后期幾丁質(zhì)含量增高，新羽化成蟲的幾丁質(zhì)含量低于最后一天的蛹。上述結(jié)果與BdCHS2基因在不同發(fā)育階段的定量表達(dá)趨勢上存在明顯的線性相關(guān)性。
　　 綜上所述，本學(xué)位論文克隆獲得了3個幾丁質(zhì)合成通路基因(BdCHS2、BdG6PI和BdUAP)cDNA全長序列，豐富了桔小實蠅的遺傳信息;在此基礎(chǔ)上，借助qPCR技術(shù)較為全面地解析這3個基