桔小實蠅遺傳控制技術(shù)體系的構(gòu)建.pdf

1、實蠅類害蟲是世界果蔬產(chǎn)業(yè)最重要的害蟲類群之一，具有寄主范圍廣、擴散速度快、適應(yīng)力強等特點，嚴重影響了發(fā)生地的果蔬生產(chǎn)和出口貿(mào)易活動，許多種類被列入了世界性檢疫害蟲的行列。桔小實蠅是我國發(fā)生范圍最廣、危害最大的一種實蠅類害蟲，對我國果蔬產(chǎn)業(yè)造成了極大危害。目前，國內(nèi)針對實蠅類害蟲主要是結(jié)合性誘劑等進行的化學(xué)防治等傳統(tǒng)防治措施，但這些措施存在抗藥性產(chǎn)生、農(nóng)藥殘留、環(huán)境污染等諸多不足，尤其是臨近發(fā)生區(qū)域內(nèi)防治時間的不同步會大大降低防治效果。國

2、際上針對這些不足，逐步形成了基于大區(qū)域綜合治理策略(Area-Wide Integrated Pest Management Approach，AW-IPM)的防控體系，該體系以不育昆蟲釋放技術(shù)(Sterile Insect Technique，SIT)為主，結(jié)合其它防治手段在大區(qū)域內(nèi)綜合治理實蠅類害蟲。
　　通過輻照破壞雄蟲精子是傳統(tǒng)SIT技術(shù)的主要手段，該技術(shù)在多個地區(qū)的蠅類害蟲的阻截、防治和滅除方面取得了重要成就，但經(jīng)輻射的

3、昆蟲存在穩(wěn)定性差、交配競爭力低、壽命短等缺點。隨著高新生物技術(shù)的快速發(fā)展，轉(zhuǎn)基因技術(shù)在昆蟲研究領(lǐng)域得到了更多的應(yīng)用，通過轉(zhuǎn)基因技術(shù)實現(xiàn)昆蟲“不育”而不降低其雄蟲競爭力的思路隨之產(chǎn)生，并得以在黑腹果蠅和地中海實蠅等物種上有了很大的進展。
　　本研究以桔小實蠅為研究對象，以通過轉(zhuǎn)基因技術(shù)改進不育昆蟲釋放技術(shù)(SIT)體系為目標；分析了達到該目標需要構(gòu)建的遺傳轉(zhuǎn)化品系的種類；克隆了構(gòu)建各轉(zhuǎn)基因載體所需的桔小實蠅內(nèi)源的分子元件；構(gòu)建了各遺

4、傳轉(zhuǎn)化品系所需的一系列載體；另外，還在地中海實蠅中獲得了胚胎條件致死品系所需驅(qū)動載體的遺傳轉(zhuǎn)化品系，這為后續(xù)在桔小實蠅中通過顯微注射開展遺傳轉(zhuǎn)化實驗，并獲得相應(yīng)遺傳轉(zhuǎn)化品系打下了基礎(chǔ)。
　　1.根據(jù)國際已有研究并加入部分創(chuàng)新思路，分析了構(gòu)建桔小實蠅遺傳控制技術(shù)體系需要構(gòu)建的遺傳轉(zhuǎn)化品系的種類(包括胚胎致死、雌性特異胚胎致死、雄性不育、精子熒光標記等品系)及相應(yīng)的構(gòu)建策略，對桔小實蠅遺傳控制項目的研究進行了總體規(guī)劃；
　　2.

5、利用RT-PCR及RACE技術(shù)分離得到桔小實蠅中母體效應(yīng)基因nanos、vasa和hunchback等的同源基因的全長cDNA，對它們進行了序列分析和系統(tǒng)發(fā)育分析，其對應(yīng)氨基酸序列與其他物種具有較高的相似性；
　　3.通過2輪反向PCR克隆了桔小實蠅nanos基因的5?上游調(diào)控區(qū)序列1964 bp(含RACE得到的165 bp的5?UTR序列)，分析發(fā)現(xiàn)該段序列中362 bp-1058 bp為TIM44基因的編碼區(qū)，所以選用105

6、8 bp之后的906 bp的片段為啟動子，構(gòu)建了桔小實蠅胚胎條件致死品系所需要的驅(qū)動載體；
　　4.對桔小實蠅hid基因進行了磷酸化位點分析，發(fā)現(xiàn)其有2個確定的磷酸化位點和1個可能的磷酸化位點，通過In-fusion克隆技術(shù)對兩個確定的磷酸化位點進行了定點突變，并用突變后的序列構(gòu)建得到了桔小實蠅條件致死系統(tǒng)所需要的效應(yīng)載體；
　　5.在已知桔小實蠅精巢特異表達基因β2-tubulin的全長cDNA的基礎(chǔ)上，通過反向PCR技術(shù)

7、克隆了其含5?UTR的上游調(diào)控序列1591 bp，并以此構(gòu)建了桔小實蠅雄蟲不育品系所需的驅(qū)動載體和2個精子熒光標記品系所需的載體；
　　6.通過 RT-PCR及 RACE技術(shù)分離得到桔小實蠅transformer和transformer-2基因的全長cDNA并進行了序列分析和系統(tǒng)發(fā)育分析，進一步分析了transformer基因的不同剪切類型，發(fā)現(xiàn)transformer基因在雄蟲中存在兩個剪切類型，在雌蟲中只有一個，然后克隆了它們的