桔小實(shí)蠅鈉離子通道基因和P450基因RNAi載體構(gòu)建及對柑橘的轉(zhuǎn)化.pdf

1、桔小實(shí)蠅Bactrocera dorsalis又名東方果實(shí)蠅，廣泛分布于中國各大柑橘產(chǎn)區(qū)，使中國的柑橘產(chǎn)業(yè)面臨著嚴(yán)重威脅，每年都對柑橘為害造成巨大經(jīng)濟(jì)損失。除此之外，還可危害柑橘、芒果和楊桃等250多種水果蔬菜和作物。目前化學(xué)防治仍是控制桔小實(shí)蠅的重要措施，然而化學(xué)農(nóng)藥施用的不當(dāng)，不僅影響果品安全，同時(shí)還會導(dǎo)致嚴(yán)重的抗性藥。因此，化學(xué)防治很難實(shí)現(xiàn)桔小實(shí)蠅的可持續(xù)控制。鈉離子通道(sodium channel，SC)基因是擬除蟲菊酯類和D

2、DT殺蟲劑對昆蟲的主要毒害作用靶標(biāo);細(xì)胞色素P450單加氧化酶系(cytochrome p450 monoxygenases，P450s)是一類在結(jié)構(gòu)性質(zhì)上類似的一族蛋白質(zhì)，有報(bào)道表明，其與昆蟲對擬除蟲菊酯類和有機(jī)氯類殺蟲劑的抗性有關(guān)。應(yīng)用RNAi技術(shù)可達(dá)到昆蟲鈉離子通道基因和P450基因不能正常表達(dá)，從而增強(qiáng)昆蟲對農(nóng)藥的敏感性、影響其發(fā)育及繁殖，因此可以通過農(nóng)桿菌介導(dǎo)植物遺傳轉(zhuǎn)化和RNAi技術(shù)獲得抗桔小實(shí)蠅材料。本試驗(yàn)將鈉離子通道JN

3、416983基因以及P450 CYP6EK1基因的特異序列作為靶標(biāo)序列，構(gòu)建這兩個(gè)基因的RNA干擾載體，采用農(nóng)桿菌介導(dǎo)轉(zhuǎn)化柑橘，旨在獲得對桔小實(shí)蠅有抗性的新材料。
　　1、RNAi干擾載體的構(gòu)建
　　NCBI上搜索桔小實(shí)蠅鈉離子通道基因和細(xì)胞色素P450基因全長序列，Blast比對其保守序列，設(shè)計(jì)特異性的兩端加相應(yīng)酶切位點(diǎn)的引物，構(gòu)建dsRNA載體。
　　A.載體PFGC5941-C1R1/C2R2的構(gòu)建:
　　

4、鈉離子通道基因正向目的片段與反向目的片段上游下游添加的限制性內(nèi)切酶分別為XhoⅠ和NcoⅠ、XbaⅠ和BamHⅠ識別序列，克隆得到相應(yīng)的正向和反向相重復(fù)的基因片段。將正向目標(biāo)基因C1R1質(zhì)粒進(jìn)行酶切，同時(shí)將載體PFGC5941質(zhì)粒用相同的兩個(gè)酶酶切，用T4連接酶將其連接，然后將連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化大腸桿菌感受態(tài)細(xì)胞，隨機(jī)挑選幾個(gè)單克隆菌落，用通用引物C1R1，PCR檢測篩選正確的單菌落，提取質(zhì)粒，然后酶切驗(yàn)證得到“PFGC5941-正向片段C1

5、R1”;將得到的“PFGC5941-C1R1”質(zhì)粒進(jìn)行酶切，同時(shí)用相同酶對反向目標(biāo)基因C2R2進(jìn)行酶切，T4連接酶連接，轉(zhuǎn)入大腸桿菌感受態(tài)細(xì)胞，隨機(jī)挑選單克隆菌落，酶切驗(yàn)證，得到載體“PFGC5941-正向片段C1R1/反向片段C2R2”。
　　B.載體PFGC5941-P1F1/P2F2的構(gòu)建:
　　構(gòu)建方法同上，在細(xì)胞色素P450基因正向目的片段兩端分別加上限制性內(nèi)切酶XhoⅠ和NcoⅠ識別序列;在反向目的片段兩端分別加

6、上XbaⅠ和BamHⅠ識別序列，通過雙酶切，T4連接酶連接后轉(zhuǎn)入大腸桿菌感受態(tài)細(xì)胞中，提取質(zhì)粒，分別進(jìn)行酶切及PCR擴(kuò)增驗(yàn)證，最終獲得載體“PFGC5941-正向片段P1F1/反向片段P2F2”。
　　2、由農(nóng)桿菌介導(dǎo)柑橘的遺傳轉(zhuǎn)化和轉(zhuǎn)基因植株的驗(yàn)證
　　將上述獲得的兩個(gè)質(zhì)粒電擊法分別轉(zhuǎn)入到農(nóng)桿菌EHA105菌株。PCR驗(yàn)證后，用含有質(zhì)粒“PFGC5941-正向片段C1R1/反向片段C2R2”的農(nóng)桿菌侵染錦橙上胚軸，用除草劑