稻縱卷葉螟魚尼丁受體基因和鈉離子通道基因的克隆與選擇性剪接分析.pdf

1、稻縱卷葉螟CnaphalocrocismedinalisGuenée(鱗翅目Lepidoptera，螟蛾科Pyralididae)，是亞熱帶國家水稻Oryzasativa(L.)（禾本目Poaceae，禾本科Graminales）最嚴(yán)重的食葉害蟲之一。近年來，稻縱卷葉螟在我國南方以及長江中下游稻區(qū)的發(fā)生和危害日趨嚴(yán)重。目前化學(xué)防治仍是有效控制稻縱卷葉螟為害的主要手段。隨著害蟲對現(xiàn)有殺蟲劑抗性的快速發(fā)展，研發(fā)具有新型作用機(jī)制的殺蟲劑至關(guān)重

2、要。本文克隆了稻縱卷葉螟魚尼丁受體和鈉離子通道基因，分析了魚尼丁受體和鈉離子通道基因剪接異構(gòu)體在稻縱卷葉螟不同發(fā)育階段和成蟲不同組織部位的表達(dá)模式，研究結(jié)果對于進(jìn)一步豐富對昆蟲魚尼丁受體和鈉離子通道結(jié)構(gòu)和功能關(guān)系的認(rèn)識以及新型高效殺蟲劑的創(chuàng)制具有重要的理論意義和實(shí)踐價值。
　　 魚尼丁受體(ryanodinereceptor,RyRs)是一類控制Ca+從胞內(nèi)鈣庫釋放的配基門控鈣離子通道。RyRs是兩類新型化學(xué)合成殺蟲劑鄰苯二甲酰

3、胺類和鄰甲酰氨基苯甲酰胺類的作用靶標(biāo)。RyRs全長cDNA克隆是了解昆蟲RyRs結(jié)構(gòu)和功能特性以及二酰胺類殺蟲劑選擇性作用機(jī)制的關(guān)鍵。本文通過反轉(zhuǎn)錄多聚酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)技術(shù)(RT-PCR)和cDNA末端快速擴(kuò)增技術(shù)(RACE)克隆了稻縱卷葉螟RyR全長cDNA，命名為CmRyR。CmRyR開放閱讀框長15264bp，編碼5087個氨基酸殘基，預(yù)測蛋白質(zhì)分子質(zhì)量為574339Da。氨基酸序列比對表明，CmRyR與家蠶和果蠅的RyR序列一致性分別

4、為94％和79％。CmRyR與已知RyRs具有共同的結(jié)構(gòu)特征。分別位于CmRyR蛋白C末端4183-4194位和4285-4296位的兩個EF-hands表明CmRyR與哺乳動物RyRs一樣，可以調(diào)節(jié)細(xì)胞內(nèi)Ca2+釋放。CmRyR在通透離子的包括選擇性濾孔基序(GGGXGD)的孔道區(qū)與哺乳動物RyRs高度相似，表明CmRyR可形成功能性Ca2+通道。多重序列比對表明，對應(yīng)于CmRyRN4922，N4924，N4935，L4950，L49

5、81，N5013和T5064的氨基酸殘基在鱗翅目昆蟲中完全一致，相應(yīng)位置的與鱗翅目昆蟲不同的氨基酸殘基在非鱗翅目昆蟲和其他無脊椎動物以及脊椎動物RyRs中高度保守，推測這些氨基酸殘基可能在鱗翅目和非鱗翅目昆蟲RyRs通道特性差異以及二酰胺類殺蟲劑選擇性毒性方面具有重要作用。此外，在CmRyR基因中發(fā)現(xiàn)兩個選擇性剪接位點(diǎn)，其中之一位于第二個SPRY結(jié)構(gòu)域中央部分。特異性PCR檢測表明，互斥外顯子(a/b)的表達(dá)具有發(fā)育階段和組織特異性。在

6、卵和成蟲頭部的所有cDNA克隆中都檢測到外顯子a，但蛹的23個cDNA克隆中和成蟲身體的21個cDNA克隆中分別檢測到16和11個外顯子a。相反，外顯子b在卵和成蟲頭部沒有檢測到，但在蛹和成蟲身體中低至中等頻率表達(dá)(30％和48％)。另外，選擇性外顯子c的表達(dá)也具有發(fā)育階段特異性。在卵、3齡幼蟲和5齡幼蟲中，外顯子c低頻率（0％，17％和10％）表達(dá)，但在1齡幼蟲和蛹中，外顯子c中等至高頻率(55％和71％）表達(dá)。這些結(jié)果表明選擇性剪接

7、可能是稻縱卷葉螟以及其他昆蟲RyR通道產(chǎn)生功能多樣性的主要方式。
　　 電壓門控鈉離子通道是擬除蟲菊酯類殺蟲劑的作用靶標(biāo)，昆蟲對擬除蟲菊酯類殺蟲劑產(chǎn)生抗性的一個重要機(jī)制稱為擊倒抗性。鈉離子通道在害蟲抗藥性中的重要作用推動了昆蟲鈉離子通道的研究。新型高效殺蟲劑茚蟲威作用于失活態(tài)鈉離子通道，破壞神經(jīng)沖動傳遞，是替代有機(jī)磷和擬除蟲菊酯類殺蟲劑的理想品種，目前已經(jīng)在我國部分地區(qū)用于稻縱卷葉螟的防治。本文利用RT-PCR和RACE克隆獲得