褐飛虱para鈉離子、NlSC1離子通道基因及三個(gè)保幼激素合成代謝中關(guān)鍵基因的研究.pdf

1、稻飛虱是亞洲地區(qū)主要的水稻害蟲，通過(guò)吸食水稻汁液和傳播水稻病毒造成水稻大面積死亡和減產(chǎn)，給世界糧食安全造成巨大的威脅。近幾十年來(lái)，化學(xué)殺蟲劑在控制稻飛虱中起著重要的作用，但是在世界各地區(qū)相繼報(bào)道了稻飛虱對(duì)各種農(nóng)藥產(chǎn)生了抗性，為了理解道稻飛虱對(duì)農(nóng)藥產(chǎn)生抗性的分子機(jī)制，也為了針對(duì)現(xiàn)有靶標(biāo)篩選新的化合物，或?qū)ふ倚碌霓r(nóng)藥靶標(biāo)，我們對(duì)除蟲菊酯類農(nóng)藥的靶標(biāo)—鈉離子通道基因、一種新的離子通道——DSC1同源基因和保幼激素合成與代謝途徑中三種關(guān)鍵基因進(jìn)

2、行了研究。
　　 DSC1是一種在結(jié)構(gòu)上與電壓門控鈉離子通道基因相似，但功能上又不同的陽(yáng)離子通道基因。用DSC1作為搜索序列對(duì)GenBank中所有基因組進(jìn)行分析，結(jié)果表明其同源基因在節(jié)肢動(dòng)物、軟體動(dòng)物、刺胞動(dòng)物、半索動(dòng)物和棘皮動(dòng)物中均有存在，但主要在節(jié)肢動(dòng)物（昆蟲綱和甲殼動(dòng)物）中，但沒有在脊椎動(dòng)物中發(fā)現(xiàn)。我們根據(jù)褐飛虱和家蠶的基因組序列，分別克隆了DSC1同源基因，被分別命名為NlSC1和BmSC1，它們分別編碼2122和222

3、5個(gè)氨基酸，與DSC1蛋白的同源性達(dá)到50％左右，主要在褐飛虱和家蠶的頭部和觸角表達(dá)。多序列比對(duì)和蛋白質(zhì)疏水性分析表明該類蛋白質(zhì)除了具有與電壓門控鈉離子和鈣離子通道蛋白同樣的模塊結(jié)構(gòu)以外，在四個(gè)結(jié)構(gòu)域的成空區(qū)有獨(dú)特的DEEA模體，在第三與第四結(jié)構(gòu)域之間的環(huán)狀區(qū)還有一獨(dú)特保守的MFL模體。系統(tǒng)進(jìn)化分析也進(jìn)一步證明這類基因沒有和鈉離子通道或鈣離子通道聚集在一個(gè)分支上，而是形成了一個(gè)獨(dú)立的分支。鑒于該類離子通道沒有在脊椎動(dòng)物中發(fā)現(xiàn)，那么針對(duì)該

4、類型離子通道的化合物或農(nóng)藥將對(duì)脊椎動(dòng)物沒有危害，所以我們認(rèn)為該類離子通道可能是一個(gè)理想的農(nóng)藥靶標(biāo)。
　　 昆蟲的鈉離子通道基因是DTT、除蟲菊酯和擬除蟲菊酯類農(nóng)藥的靶標(biāo)基因。用果蠅Para鈉離子蛋白序列在褐飛虱基因組中進(jìn)行搜索，發(fā)現(xiàn)一個(gè)同源基因，用RT-PCR和RACE技術(shù)克隆出來(lái)褐飛虱para鈉離子通道基因，對(duì)其ORF擴(kuò)增，獲得10種類型，其中最長(zhǎng)的ORF長(zhǎng)6215 bp，編碼2084個(gè)氨基酸.序列比對(duì)發(fā)現(xiàn)6個(gè)RNA可變剪切位

5、點(diǎn)和10個(gè)RNA編輯位點(diǎn)。褐飛虱Para蛋白中包含35個(gè)PKA磷酸化位點(diǎn)、47個(gè)PKC磷酸化位點(diǎn)和8個(gè)N-糖基化位點(diǎn)。實(shí)時(shí)定量PCR結(jié)果顯示褐飛虱para鈉離子基因主要在觸角和頭部表達(dá)。現(xiàn)在已經(jīng)有5種克隆正在進(jìn)行電生理試驗(yàn)，其結(jié)果將對(duì)于理解這些RNA可變剪切和RNA編輯的功能提供幫助。
　　 保幼激素在昆蟲的生長(zhǎng)、發(fā)育、變態(tài)和繁殖等過(guò)程中起著關(guān)鍵作用，為了理解稻飛虱保幼激素合成與代謝途徑，方便針對(duì)保幼激素合成與代謝途徑中的酶篩選

6、和合成抑制劑用于農(nóng)藥領(lǐng)域，根據(jù)褐飛虱轉(zhuǎn)錄組序列，我們RT-PCR和RACE技術(shù)克隆了保幼激素環(huán)氧水解酶、保幼激素酸甲基轉(zhuǎn)移酶和法呢基焦磷酸合成酶等三個(gè)關(guān)鍵基因，它們的cDNA全長(zhǎng)分別為2114 bp、1144 bp和2214 bp，編碼454、279和393個(gè)氨基酸。在昆蟲細(xì)胞中對(duì)這三個(gè)基因進(jìn)行真核表達(dá)，試驗(yàn)表明它們分別表達(dá)52、32和45 kDa的蛋白，這與預(yù)期分子大小一致。實(shí)時(shí)定量PCR結(jié)果表明:保幼激素環(huán)氧水解酶在褐飛虱蛻皮和羽化