轉(zhuǎn)Cry30Fa1基因抗褐飛虱水稻的研究.pdf

1、本研究以優(yōu)良的水稻恢復(fù)系蜀恢818(R818)為受體材料，采用農(nóng)桿菌介導(dǎo)的遺傳轉(zhuǎn)化方法，將本實驗室克隆的抗褐飛虱基因Cry30Fa1轉(zhuǎn)入其中，通過連續(xù)自交和DNA檢測在T6代獲得了目的基因純合的轉(zhuǎn)基因株系。通過目的基因PCR檢測和抗性表達鑒定，確定T5、T6代轉(zhuǎn)基因材料中的選擇標記基因Hyg(R)和抗蟲基因Cry30Fa1，最終篩選到無選擇標記基因的轉(zhuǎn)基因水稻株系。采用實時熒光定量PCR技術(shù)檢測Cry30Fa1基因的轉(zhuǎn)錄情況。同時，基于

2、實時熒光定量PCR技術(shù)也檢測了轉(zhuǎn)基因材料中的Cry30Fa1基因拷貝數(shù)。采用Western Blot檢測Cry30Fa1基因蛋白表達情況。采用苗期集團抗蟲性鑒定法、苗期單株抗蟲性鑒定法和田間抗蟲性鑒定法，分別對3個轉(zhuǎn)基因株系進行了抗蟲性分析，篩選到中抗以上水平的抗褐飛虱轉(zhuǎn)基因水稻株系。此外，我們還對T6代轉(zhuǎn)基因水稻株系的主要農(nóng)藝性狀進行了調(diào)查。主要結(jié)果如下:
　　1.對T5代的184個轉(zhuǎn)基因株系進行Cry30Fa1基因的PCR檢測

3、，發(fā)現(xiàn)其中150個株系含有Cry30Fa1基因，而且T6代跟蹤檢測中篩選到29個目的基因純合的轉(zhuǎn)基因株系。通過對29個轉(zhuǎn)基因株系進行了Hyg(R)基因PCR檢測和浸泡表達檢測，最終獲得了15個無選擇標記基因的轉(zhuǎn)基因株系。
　　2.通過實時熒光定量PCR技術(shù)，本研究對29個T6代轉(zhuǎn)基因株系的Cry30Fa1基因在轉(zhuǎn)錄水平上的表達進行了檢測，結(jié)果顯示，所有轉(zhuǎn)基因株系的Cry30Fa1基因在轉(zhuǎn)錄水平上均有表達，但表達量差異較大，相對表達

4、量在0.19-8.53之間。
　　3.通過Western Blot技術(shù)，本研究對29個T6代轉(zhuǎn)基因株系Cry30Fa1基因在蛋白質(zhì)水平上的表達進行了檢測，結(jié)果顯示，5個轉(zhuǎn)基因株系中沒有檢測到Bt蛋白質(zhì)，余下的24個轉(zhuǎn)基因株系的Bt蛋白均有表達，但轉(zhuǎn)基因株系中Bt蛋白表達量存在較大差異，分布在0.13到11.6之間。
　　4.通過分析了轉(zhuǎn)基因植株中Cry30Fa1基因拷貝數(shù)，本研究發(fā)現(xiàn)29個轉(zhuǎn)基因株系中Cry30Fa1基因拷貝

5、數(shù)存在較大差異，但有15個株系的拷貝數(shù)屬于低拷貝的株系。
　　5.采用苗期集團抗蟲性鑒定法和田間抗蟲性鑒定法對其中3個轉(zhuǎn)基因株系進行了抗蟲性分析，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，苗期抗性均達到了7級，屬于中感材料;田間抗性達到3-5級，屬于中抗到抗的材料。同時，采用苗期單株抗蟲性鑒定法，對以上3個轉(zhuǎn)基因株系進行了殺蟲性分析，結(jié)果表明，3個轉(zhuǎn)基因株系中的褐飛虱死亡率顯著高于親本R818，這說明了轉(zhuǎn)基因株系增加了殺蟲能力。
　　6.通過對29個轉(zhuǎn)基因

6、株系主要農(nóng)藝性狀進行分析，結(jié)果表明，外源Bt基因?qū)λ局旮哂绊懽畲?，?9個株系與親本之間存在顯著性差異;外源Bt基因?qū)ζ渌r(nóng)藝性狀如抽穗期、有效分蘗數(shù)、主穗長、結(jié)實率、千粒重等的影響較小。通過數(shù)據(jù)分析發(fā)現(xiàn)性狀得到改良的株系比性狀變差的株系多，這說明通過分子水平檢測和田間選育工作相結(jié)合，總會選到和親本相似農(nóng)藝性狀甚至是優(yōu)于親本的轉(zhuǎn)基因株系。
　　目前，正在對余下的26個轉(zhuǎn)基因株系進行全面抗蟲性分析，以期獲得更多抗褐飛虱的轉(zhuǎn)基因株系