水稻褐飛虱對蘇云金桿菌Cry毒素不敏感機(jī)制研究.pdf

1、目前針對半翅目褐飛虱等刺吸性口器害蟲具有明顯毒性的Bt Cry毒素鮮有報道。已知的作用模型顯示Cry毒素在靶標(biāo)昆蟲消化道內(nèi)的作用機(jī)制包括晶體蛋白的溶解、原毒素的活化、毒素與中腸受體蛋白的結(jié)合及中腸上皮細(xì)胞膜穿孔的生成等步驟。在上述過程中Cry原毒素蛋白在靶標(biāo)昆蟲消化道內(nèi)的活化及活化后的毒素片段與中腸受體蛋白的正確結(jié)合是引發(fā)Cry殺蟲作用的最關(guān)鍵步驟。
　　本研究選取對鱗翅目、鞘翅目及雙翅目蚊子有效的 Cry1Ac、Cry3Aa和

2、Cry4Ba毒素蛋白，并對 Cry1Ac進(jìn)行改造，得到了刪除Helixα1的突變株Cry1Ac-α，利用膜飼喂法分別測定了上述Cry蛋白及突變株對褐飛虱若蟲的毒力。結(jié)果顯示所有供試Cry毒素均無法對褐飛虱產(chǎn)生較好的毒性作用。其中，Cry1Ac對褐飛虱的毒力作用相對較好，Cry1Ac原毒素的LC50為198.92μg/mL，Cry1Ac活化毒素的LC50為450.18μg/mL，改造后的Cry1Ac-α毒素的LC50為166.92μg/m

3、L，毒性作用較原毒素有小幅提高，但只有 Cry1Ac對鱗翅目原始靶標(biāo)的近1/200；而 Cry3Aa毒素對褐飛虱則顯示出極其微弱的毒性作用，其原毒素及活化毒素對褐飛虱的 LC50分別達(dá)到了1810.50μg/mL和2895.55μg/mL；此外Cry4Ba對褐飛虱的毒性作用也不明顯，其原毒素和活化毒素對褐飛虱的LC50分別為760.83μg/mL及523.16μg/mL。因此，從生測結(jié)果來看，褐飛虱對上述Cry毒素均不敏感。從Cry毒素

4、發(fā)揮殺蟲作用的兩個關(guān)鍵環(huán)節(jié)（毒素的水解活化及其與昆蟲中BBMV的結(jié)合）對褐飛虱若蟲的不敏感性機(jī)制進(jìn)行了分析。首先，分別對3種Cry毒素在褐飛虱中腸酶作用下的水解及穩(wěn)定性進(jìn)行了研究。結(jié)果顯示Cry1Ac原毒素能夠順利地被褐飛虱腸道酶液水解成為穩(wěn)定的~65 kDa片段，且與半胱氨酸蛋白酶的激活與否無關(guān)，但活化片段略大于胰蛋白酶水解產(chǎn)生的~60 kDa的 Cry1Ac毒性片段；從Cry3Aa的情況來看，無論有沒有激活半胱氨酸蛋白酶，腸腔酶液對

5、Cry3Aa都沒有水解作用，不能將Cry3Aa正確水解至~55 kDa的活性片段，而腸膜酶液對其也只具有很有限的水解作用；而激活了半胱氨酸蛋白酶活性的腸腔酶液則能夠?qū)?Cry4Ba原毒素進(jìn)行水解，并達(dá)到胰蛋白酶水解的活性片段大小，但在16 h時水解也并不完全。其次，分析了預(yù)活化的3種Cry毒素與褐飛虱中腸的結(jié)合特異性。結(jié)果顯示經(jīng)胰蛋白酶活化后的Cry1Ac、Cry3Aa、Cry4Ba毒素均能夠與褐飛虱及其原始靶標(biāo)昆蟲中腸 BBMV在不同

6、的程度上特異性結(jié)合。其中， Cry4Ba與褐飛虱中腸BBMV的結(jié)合能夠被N-乙酰葡萄糖胺競爭，而Cry1Ac毒素與褐飛虱中腸 BBMV的結(jié)合并未被 N-乙酰半乳糖胺所競爭。Cry3Aa毒素與黃粉蟲及褐飛虱中腸BBMV的結(jié)合則并未被上述兩種糖所競爭，即Cry1Ac及Cry3Aa雖然能夠與褐飛虱中腸BBMV產(chǎn)生特異性結(jié)合，但其結(jié)合的位點(diǎn)并非常規(guī)Cry作用機(jī)制中的糖蛋白。研究證實(shí)了3種典型Cry毒素對非Bt靶標(biāo)昆蟲褐飛虱沒有明顯毒性作用，分析