灰飛虱離子型GABA受體的基因克隆及功能研究.pdf

1、在脊椎和無脊椎動物體內(nèi)，離子型γ-氨基丁酸受體主要介導(dǎo)神經(jīng)和肌肉細(xì)胞中快速的抑制性突觸傳遞。作為環(huán)戊二烯類和苯基吡唑類殺蟲劑的重要分子靶標(biāo)，昆蟲的GABA受體一直都是毒理學(xué)研究的熱點(diǎn)，然而近些年來殺蟲劑濫用導(dǎo)致的害蟲抗藥性問題以及對環(huán)境不友好的標(biāo)簽降低了這些殺蟲劑的使用頻率，但GABA受體亞基類型和結(jié)構(gòu)的多樣性又為開發(fā)和創(chuàng)制新型殺蟲劑提供了條件。本文以農(nóng)業(yè)害蟲灰飛虱Laodelphax Striatellus(Fallén)為對象，利用

2、現(xiàn)代分子生物學(xué)技術(shù)對其離子型GABA受體進(jìn)行了基因與功能的相關(guān)研究。
　　一、灰飛虱離子型GABA受體的基因克隆及序列分析
　　通過序列比對發(fā)現(xiàn)，所得到的這兩個(gè)基因編碼的氨基酸序列具有昆蟲離子型GABA受體亞基的典型結(jié)構(gòu)，并與其他昆蟲相比有很高的同源性，高達(dá)90％以上，因此認(rèn)為所克隆得到的基因就是灰飛虱離子型GABA受體的GRD和LCCH3亞基;另外在對室內(nèi)敏感/抗性品系灰飛虱RDL亞基基因克隆的過程中發(fā)現(xiàn)，灰飛虱的Lsrd

3、l基因外顯子3和外顯子6分別存在著三種(3a，3b，3c)和兩種(6a，6b)可變剪接，它們可以形成頻率不同的4種剪接體(Lsrdl-3a6b，Lsrdl-3b6b，Lsrdl-3b6a和Lsrdl-3c6b)，其中Lsrdl-3c6b的出現(xiàn)頻率最高(50％)。
　　二、灰飛虱離子型GABA受體基因的表達(dá)模式
　　采用熒光定量PCR技術(shù)對灰飛虱離子型GABA受體三個(gè)亞基基因(Lsrdl，Lsgrd和Lslcch3)的表達(dá)模式

4、進(jìn)行了研究。結(jié)果表明，三個(gè)基因在灰飛虱整個(gè)發(fā)育階段均有存在，且隨著齡期的增長其相對表達(dá)量呈現(xiàn)先降低后升高的趨勢，其中Lsrdl在卵期和成蟲期相對表達(dá)量較高，而Lslcch3和Lsgrd在五齡若蟲期和成蟲期相對表達(dá)量較高;在成蟲階段，雌成蟲的相對表達(dá)量均高于雄成蟲。三個(gè)基因在灰飛虱的頭、胸、腹和足均有存在，頭部的相對表達(dá)量要顯著高于其他組織。
　　三、灰飛虱對氟蟲腈靶標(biāo)抗性的分子檢測技術(shù)
　　通過多年的室內(nèi)篩選，抗性品系灰飛虱

5、的RDL亞基已產(chǎn)生了與氟蟲腈抗性有關(guān)的A2'N突變，按照等位基因特異性PCR擴(kuò)增(AS-PCR)技術(shù)的原理，本試驗(yàn)設(shè)計(jì)了特異性引物，建立了灰飛虱對氟蟲腈靶標(biāo)抗性的分子檢測技術(shù)。通過對敏感品系、抗性品系和田間品系的灰飛虱個(gè)體進(jìn)行檢測，發(fā)現(xiàn)敏感品系和田間品系的灰飛虱個(gè)體中均為敏感純合子，抗性品系個(gè)體多為雜合子（91％以上），少數(shù)為抗性突變/敏感純合子。該技術(shù)具有靈敏度高和準(zhǔn)確度好的特點(diǎn)，可以為灰飛虱對苯基呲唑類殺蟲劑的田間抗藥性監(jiān)測提供參考

6、。
　　四、灰飛虱離子型GABA受體RDL亞基的功能研究
　　RNA干擾技術(shù)為昆蟲基因的功能研究和尋找新農(nóng)藥靶標(biāo)提供了新的技術(shù)途徑。本章通過顯微注射的方法，將體外合成的功能基因dsRNA(dsLsrdl)導(dǎo)入到灰飛虱體內(nèi)，研究其沉默效率及受體功能。試驗(yàn)表明，在注射dsRNA后的六天之內(nèi)均可使RDL亞基的轉(zhuǎn)錄本(transcripts)顯著沉默，干擾效率于第四天達(dá)到最高(82.4％);進(jìn)一步采用生物方法對敏感/抗性品系的三齡初