褐飛虱Met基因的克隆及其功能研究.pdf

1、褐飛虱（Nilaparvata lugensSt?l）屬于不完全變態(tài)昆蟲，具有長翅和短翅兩種翅型。褐飛虱專一性的取食水稻，它是亞洲最具有破壞性的水稻害蟲，因此其爆發(fā)成災(zāi)是嚴(yán)重威脅水稻的產(chǎn)量。保幼激素（Juvenile hormone，JH）在昆蟲的生長發(fā)育中起到重要的調(diào)節(jié)作用，然而到目前為止，JH信號傳導(dǎo)機(jī)制尚不明確。bHLH-PAS家族成員 Methoprene-tolerant（Met）是JH的受體，Met蛋白在接受 JH信號后，首

2、先與具有相同 DNA結(jié)合結(jié)構(gòu)域的Tai/SRC/FISC蛋白形成二聚體，然后通過識別JH反應(yīng)元件，啟動(dòng)下游轉(zhuǎn)錄因子 Kr-h1等基因的表達(dá)。
　　本研究以褐飛虱為對象，從褐飛虱中克隆的NlMet基因，包含517個(gè)氨基酸，具有典型的bHLH-PAS結(jié)構(gòu)，包括 bHLH，PAS-A，PAS-B和PAC四個(gè)結(jié)構(gòu)域，其中 PAS-B和PAC保守性較高，而 bHLH和PAS-A保守性相對較低。我們也利用熒光定量 PCR技術(shù)探究了 Met基因

3、在褐飛虱不同發(fā)育時(shí)期、不同組織和烯蟲酯誘導(dǎo)等條件下的表達(dá)特性。結(jié)果顯示，NlMet基因在所有組織中都有表達(dá)，在胚胎期的表達(dá)量最高，在若蟲階段的表達(dá)量存在差異，在成蟲中的表達(dá)量則相對穩(wěn)定（如圖2.5）。經(jīng)烯蟲酯誘導(dǎo)后，NlMet基因的表達(dá)量顯著增加。
　　通過雙鏈 RNA干擾褐飛虱4齡、5齡若蟲，觀察并統(tǒng)計(jì)羽化后成蟲的蛻皮情況及外生殖器畸形比率，并對羽化后的雌性成蟲做進(jìn)一步研究，分析RNA干擾對卵巢發(fā)育的影響。我們發(fā)現(xiàn)在 Met和K

4、r-h1基因沉默后，褐飛虱在若蟲向成蟲發(fā)育的過程中出現(xiàn)了不同程度的死亡，其中若蟲蛻皮的死亡率最高，其次為初羽化短翅雌蟲，再次為初羽化短翅型和長翅型雄蟲，初羽化長翅型褐飛虱雌蟲的死亡率為0。此外，干擾后的若蟲以及雌雄成蟲生殖器均出現(xiàn)了不同程度的畸形。dsGFP與 dsNlMet注射4齡、5齡若蟲后，對外生殖器的發(fā)育沒有顯著影響；dsNlKr-h1注射4齡若蟲，其羽化后的雌蟲外生殖器則有顯著影響；然而，NlMet+NlKr-h1沉默后對若蟲

5、，雌蟲和雄蟲的外生殖器均有影響。說明 NlMet基因與下游轉(zhuǎn)錄因子NlKr-h1存在相互作用，且對褐飛虱變態(tài)發(fā)育起調(diào)節(jié)作用，影響若蟲到成蟲的變態(tài)和外生殖器的發(fā)育。
　　保幼激素類似物烯蟲酯處理對卵巢管數(shù)沒有影響，但是降低了短翅型卵巢的發(fā)育速度。通過研究 NlMet、NlKrh-1或 NlMet+NlKr-h1沉默后雌成蟲的卵巢發(fā)育發(fā)現(xiàn)，與對照組相比，對4齡若蟲羽化的雌成蟲的卵巢管數(shù)沒有影響，但當(dāng)干擾5齡若蟲時(shí)則顯著降低了羽化的雌成

6、蟲的卵巢管數(shù)（P=0.05）。此外，卵巢發(fā)育速度也變慢，即卵巢分級與對照組有顯著差異（P=0.05）。NlMet+NlKr-h1雙鏈 RNA干擾5齡若蟲后羽化的雌成蟲的卵巢發(fā)育速度最慢，亦表明NlMet和NlKr-h1可能存在相互作用。NlMet、NlKr-h1或 NlMet+NlKr-h1雙鏈 RNA干擾5齡若蟲后羽化的雌成蟲產(chǎn)卵數(shù)量均顯著降低。上述結(jié)果顯示，在褐飛虱卵巢的發(fā)育及卵子成熟的過程中，都需要保幼激素受體 NlMet及其下游

7、的轉(zhuǎn)錄因子 NlKr-h1。
　　NlMet基因是赤擬谷盜（Tribolium castaneum）和果蠅（Drosophila melanogaster）等 Met基因的同源基因，參與 JH信號傳導(dǎo)，作為 JH受體調(diào)節(jié)褐飛虱的生長發(fā)育。保幼激素是影響褐飛虱變態(tài)和卵巢發(fā)育的重要因子，其信號的正常傳遞是褐飛虱變態(tài)、外生殖器發(fā)育及卵巢發(fā)育所需，因此，本研究為 JH信號傳導(dǎo)機(jī)制的研究提供理論依據(jù)，可用于褐飛虱的防治，最終達(dá)到控制種群的目