褐飛虱Dnmt3及翅發(fā)育相關(guān)基因的表達(dá)和功能分析.pdf

1、褐飛虱（Nilaparvata lugens）是一種為害水稻生產(chǎn)的重要農(nóng)業(yè)害蟲，食性單一，只能在水稻和普通野生稻上取食和繁殖后代，但繁殖速度快且繁殖量大，是我國(guó)及許多亞洲國(guó)家水稻生產(chǎn)上的重要害蟲。本文克隆了褐飛虱DNA甲基轉(zhuǎn)移酶Dnmt3的全長(zhǎng)cDNA，進(jìn)行了結(jié)構(gòu)與進(jìn)化分析，檢測(cè)了Dnmt3在褐飛虱整個(gè)發(fā)育階段的表達(dá)水平。分別對(duì)Dnmt1和Dnmt3進(jìn)行了RNA干擾，發(fā)現(xiàn)后代數(shù)量明顯減少，表明褐飛虱DNA甲基化對(duì)繁殖力具有一定的影響。此

2、外，還對(duì)其他翅發(fā)育相關(guān)的基因進(jìn)行了干擾分析。
　　1.褐飛虱Dnmt3的全長(zhǎng)克隆及基因結(jié)構(gòu)分析
　　從褐飛虱轉(zhuǎn)錄組中獲得了DNA甲基轉(zhuǎn)移酶Dnmt3的基因序列片段。通過RT-PCR進(jìn)行序列片段驗(yàn)證后，利用RACE技術(shù)獲得了該基因的cDNA全長(zhǎng)序列(GenBank登錄號(hào)為KP890855)。Dnmt3基因的cDNA序列全長(zhǎng)為2，040個(gè)堿基，包括5'非編碼區(qū)的316個(gè)堿基，開放閱讀框的1，230個(gè)堿基和3'非編碼區(qū)的494個(gè)堿

3、基，編碼409個(gè)氨基酸。對(duì)禍飛虱Dnmt3的基因序列和蛋白序列進(jìn)行了蛋白結(jié)構(gòu)域、多序列比對(duì)、基因結(jié)構(gòu)及系統(tǒng)進(jìn)化樹分析。結(jié)果表明，褐飛虱DNMT3只含有1個(gè)具有催化活性的DNA methylase domain，不同昆蟲DNMT3的DNA methylase domain氨基酸序列相似性很高。褐飛虱DNMT3與苜蓿切葉蜂和佛羅里達(dá)弓背蟻DNMT3的相似性達(dá)到50％以上。不同物種Dnmt3基因長(zhǎng)度相差較大，褐飛虱基因序列長(zhǎng)度與高等膜翅目的兩

4、種蜂相近。與脊椎動(dòng)物相比，昆蟲外顯子更長(zhǎng)，但數(shù)量明顯偏少。系統(tǒng)進(jìn)化樹分析表明，褐飛虱Dnmt3與膜翅目昆蟲同源基因具有較近的進(jìn)化距離。
　　2.褐飛虱Dnmt3在不同發(fā)育階段的表達(dá)分析
　　對(duì)褐飛虱不同發(fā)育階段的Dnmt3基因表達(dá)量進(jìn)行了分析，檢測(cè)了Dnmt3在褐飛虱1至5齡若蟲、羽化24h內(nèi)未產(chǎn)卵的長(zhǎng)短翅雌蟲、處于產(chǎn)卵盛期的長(zhǎng)短翅雌蟲、長(zhǎng)短翅雄蟲中表達(dá)量的變化情況。結(jié)果表明，Dnmt3的表達(dá)量在褐飛虱若蟲階段的表達(dá)量很低，

5、而且不同齡期間的差異不明顯。在成蟲階段，不同時(shí)期存在較大差異。短翅型產(chǎn)卵盛期雌蟲表達(dá)量顯著高于長(zhǎng)翅型產(chǎn)卵盛期雌蟲;羽化24h內(nèi)未產(chǎn)卵的雌蟲和雄蟲，短翅型表達(dá)量稍高于同一時(shí)期的長(zhǎng)翅型，但差異不明顯。無論何種翅型，處于產(chǎn)卵盛期的雌蟲表達(dá)量均高于羽化24h內(nèi)未產(chǎn)卵的雌蟲和若蟲，雄蟲表達(dá)量最低。為進(jìn)一步明確成蟲階段的動(dòng)態(tài)變化，選取1-7d不同日齡的短翅型雌蟲、短翅型雄蟲、長(zhǎng)翅型雌蟲和長(zhǎng)翅型雄蟲進(jìn)行表達(dá)量分析。結(jié)果表明，短翅型雌蟲表達(dá)量在整個(gè)成蟲

6、發(fā)育階段，大致呈上升趨勢(shì)，且表達(dá)量達(dá)到高峰的時(shí)期與產(chǎn)量盛期的時(shí)間大致吻合。在成蟲發(fā)育階段，短翅型雌蟲表達(dá)量顯著高于長(zhǎng)翅型雌蟲，雄蟲的表達(dá)量最低。
　　3.褐飛虱Dnmt1和Dnmt3的RNA干擾分析
　　通過試劑盒體外合成Dnmt1和Dnmt3的dsRNA，采用顯微注射法對(duì)其進(jìn)行注射干擾，從胸部背面注射處于產(chǎn)卵盛期的雌性短翅褐飛虱體內(nèi)，注射量為200nl，注射濃度為2，500 ng/μl，每只蟲子注射量大約500ng dsR

7、NA。每個(gè)重復(fù)30頭雌蟲，共三個(gè)重復(fù)。干擾注射后，30只雌蟲放置于一個(gè)燒杯中，另放置20只雄性個(gè)體供交配。與對(duì)照相比，各組試蟲在注射dsRNA后24h、48h、72h，Dnmt1和Dnmt3基因的表達(dá)量均顯著降低，表明對(duì)這兩個(gè)基因的RNA干擾都具有效果。待親代產(chǎn)卵結(jié)束后，觀察后代的個(gè)體數(shù)量，發(fā)現(xiàn)干擾Dnmt1后，后代數(shù)量極顯著減少(P＜0.01);而干擾Dnmt3后，后代數(shù)量顯著減少(P＜0.05)。研究結(jié)果表明，DNA甲基化與褐飛虱的

8、高繁殖力具有密切的關(guān)系。
　　4.褐飛虱翅發(fā)育相關(guān)基因的RNA干擾分析
　　從數(shù)據(jù)庫(kù)Flybase中獲得與果蠅翅發(fā)育相關(guān)的3個(gè)基因Awd,Sl和Wmd，在褐飛虱基因組中進(jìn)行同源搜索。根據(jù)褐飛虱這3個(gè)基因序列設(shè)計(jì)并合成相應(yīng)的dsRNA,選取褐飛虱2齡若蟲進(jìn)行喂食干擾實(shí)驗(yàn)，dsRNA終濃度為200ng/μl。利用熒光定量PCR技術(shù)對(duì)干擾后不同時(shí)間點(diǎn)的基因表達(dá)量變化進(jìn)行檢測(cè)，結(jié)果表明，這3個(gè)基因被干擾后表達(dá)量均有明顯降低(P＜0.