褐飛虱Insulin-PI3K-Akt通路相關(guān)基因的克隆及功能研究.pdf

1、褐飛虱Nilaparvata lugensSt?l是一種嚴(yán)重威脅水稻產(chǎn)量的害蟲(chóng)。種植抗性水稻是防治褐飛虱的重要手段，但隨著抗性水稻持續(xù)廣泛的種植，褐飛虱對(duì)抗性水稻的適應(yīng)能力也隨之增強(qiáng)，使得原有的一些抗性水稻品種抗性失效。研究褐飛虱致害性變異機(jī)制對(duì)抗性水稻的培育及褐飛虱的防治均具有非常重要的意義。Insulin/PI3K/Akt信號(hào)通路在生物體的生長(zhǎng)發(fā)育、個(gè)體大小以及耐受性等方面起著非常重要的調(diào)控作用，該通路受到抑制時(shí)生物體的生長(zhǎng)發(fā)育會(huì)延

2、遲，體型會(huì)變小，同時(shí)耐受性會(huì)增加。這些現(xiàn)象與褐飛虱在適應(yīng)抗性水稻過(guò)程中的表現(xiàn)非常相似。因此，研究Insulin/PI3K/Akt信號(hào)通路在褐飛虱中的功能，有利于揭示褐飛虱致害性變異機(jī)制。本研究根據(jù)褐飛虱轉(zhuǎn)錄組提供的核心序列信息，用cDNA末端快速克隆技術(shù)（RACE）克隆得到了該通路相關(guān)的3個(gè)基因的全長(zhǎng)cDNA，分別為蛋白激酶B互作蛋白基因（NlAKTIP），磷脂酰肌醇3激酶p85α亞基基因（NlPIK3R1）和核糖體蛋白S6激酶基因（N

3、lRPS6KA2）。應(yīng)用熒光定量PCR技術(shù)對(duì)3個(gè)基因在不同發(fā)育時(shí)期以及褐飛虱從感性水稻品種TN1轉(zhuǎn)到抗性水稻品種 RHT過(guò)程中的表達(dá)規(guī)律進(jìn)行了測(cè)定，并利用 RNAi技術(shù)研究了NlAKTIP和NlPIK3R12個(gè)基因在褐飛虱體內(nèi)的生理功能。研究結(jié)果如下：
　　一、褐飛虱蛋白激酶B互作蛋白基因NlAKTIP的克隆、表達(dá)和功能研究
　　根據(jù)褐飛虱轉(zhuǎn)錄組提供的蛋白激酶 B互作蛋白基因核心序列信息，應(yīng)用RACE技術(shù)克隆得到了 NlAK

4、TIP基因全長(zhǎng) cDNA，全長(zhǎng)為964 bp。熒光定量PCR結(jié)果表明，NlAKTIP基因在褐飛虱各個(gè)齡期以及不同性別成蟲(chóng)中均有表達(dá)，且在懷卵褐飛虱中表達(dá)量最高，說(shuō)明該基因?qū)τ鸹蟠菩院诛w虱卵巢及卵的發(fā)育至關(guān)重要。同時(shí)發(fā)現(xiàn) NlAKTIP基因表達(dá)量在褐飛虱適應(yīng)抗性水稻品種 RHT的過(guò)程中（RF1-RF5種群）呈現(xiàn)下調(diào)的趨勢(shì)，而在適應(yīng)抗性水稻品種 RHT后的Rh種群會(huì)有所上調(diào)。RNAi結(jié)果表明，隨著干擾濃度的遞增，褐飛虱的體重也隨之減輕、體

5、型也越小。低濃度干擾組平均體重為1.36 mg，中濃度和高濃度干擾組分別為1.34mg和0.77mg，與空白對(duì)照組（2.21 mg）和dsGFP對(duì)照組（1.74 mg）的體重相比存在顯著差異（P<0.05）。該基因的干擾后還會(huì)導(dǎo)致褐飛虱羽化和卵巢發(fā)育的推遲。如，高濃度干擾組可以推遲褐飛虱羽化7天以上，當(dāng)該實(shí)驗(yàn)組褐飛虱的卵巢發(fā)育到 II級(jí)階段時(shí)，空白對(duì)照和dsGFP對(duì)照組的卵巢已發(fā)育到 IV級(jí)。以上研究結(jié)果顯示，NlAKTIP與褐飛虱的生

6、長(zhǎng)發(fā)育和體型大小有著密切聯(lián)系。
　　二、褐飛虱磷脂酰肌醇3激酶p85α亞基基因NlPIK3R1的克隆、表達(dá)分析和功能研究
　　根據(jù)褐飛虱轉(zhuǎn)錄組提供的PI3K p85α亞基基因核心序列信息，應(yīng)用RACE技術(shù)獲得了編碼PI3K p85α亞基基因NlPIK3R1，cDNA序列全長(zhǎng)為2694 bp。熒光定量PCR測(cè)定結(jié)果表明，NlPIK3R1基因在褐飛虱若蟲(chóng)和雄蟲(chóng)中表達(dá)量均較低，但在懷卵雌蟲(chóng)中大量表達(dá)。另外，NlPIK3R1基因表達(dá)

7、量在褐飛虱適應(yīng)抗性水稻品種 RHT的過(guò)程中呈現(xiàn)下調(diào)的趨勢(shì)，說(shuō)明該基因參與了褐飛虱致害性變異的過(guò)程。通過(guò)喂食 dsNlPIK3R1對(duì) NlPIK3R1基因進(jìn)行 RNA干擾，導(dǎo)致靶標(biāo)基因的表達(dá)明顯受到抑制，高濃度組的抑制效果尤為明顯。喂食 dsNlPIK3R1對(duì)褐飛虱具有極顯著致死效果，高濃度組的褐飛虱在飼喂第7 d時(shí)，存活率僅為37.5％，相比于空白對(duì)照組87.00%和dsGFP對(duì)照組76.67%，均達(dá)到了極顯著差異（P<0.01）。對(duì)

8、NlPIK3R1基因干擾還可導(dǎo)致褐飛虱羽化速率變慢和體重變輕。本研究結(jié)果顯示，NlPIK3R1基因?qū)诛w虱的生存、生長(zhǎng)和發(fā)育具有重要作用，干擾結(jié)果與褐飛虱在適應(yīng)抗性水稻上的表現(xiàn)相符，表明該基因在褐飛虱致害性變異的過(guò)程中可能起著非常重要的作用。
　　三、褐飛虱核糖體蛋白S6激酶基因NlRPS6KA2的克隆與表達(dá)分析
　　根據(jù)褐飛虱轉(zhuǎn)錄組提供的核糖體蛋白 S6激酶基因核心序列信息，應(yīng)用RACE技術(shù)獲得了編碼核糖體蛋白 S6激酶基

9、因 NlRPS6KA2，cDNA全長(zhǎng)為2491 bp。通過(guò)熒光定量 PCR對(duì)該基因進(jìn)行時(shí)序表達(dá)檢測(cè)，發(fā)現(xiàn)NlRPS6KA2在不同齡期和不同性別的褐飛虱中均有表達(dá)，且表達(dá)量較低，在懷卵雌蟲(chóng)中則大量表達(dá)，說(shuō)明該基因也與褐飛虱的卵巢及卵發(fā)育相關(guān)。同時(shí)發(fā)現(xiàn)NlRPS6KA2基因表達(dá)規(guī)律在褐飛虱適應(yīng)抗性水稻品種 RHT的過(guò)程中與 NlAKTIP和NlPIK3R1相似，都呈現(xiàn)先下調(diào)后上調(diào)的趨勢(shì)，說(shuō)明NlRPS6KA2基因也參與了褐飛虱致害性變異過(guò)程