PI3K-Akt通路重要分子的相互作用篩選及初步研究.pdf

1、肝臟是人體內(nèi)綜合性的“生物化學工廠”，承擔多種生理功能。蛋白質(zhì)-蛋白質(zhì)相互作用是一切生命活動的基礎，研究肝臟蛋白質(zhì)在相互作用中形成的復雜網(wǎng)絡是全面認識肝臟生理功能、理解其分子調(diào)控機理的重要手段。 細胞生長因子在肝臟生長發(fā)育、損傷和修復及功能調(diào)控中起關鍵作用。與肝臟相關的生長因子包括HGF、EGF、insulin、TGFs等，激活MAPK、PI3K/Akt、SMAD等多條主要信號途徑，引起肝細胞增殖、存活、細胞遷移、管狀結構發(fā)生等

2、多種生物學效應。開展肝臟相關生長因子信號途徑蛋白相互作用網(wǎng)絡研究，是中國人類肝臟蛋白質(zhì)組計劃(CNHLPP)之蛋白質(zhì)相互作用連鎖圖研究專題的重要組成部分。 蛋白質(zhì)絲/蘇氨酸激酶Akt調(diào)控包括細胞存活、增殖、生長、凋亡和糖原代謝在內(nèi)的多種生物學事件，在細胞增殖、凋亡、細胞遷移和葡萄糖代謝等過程中充當著關鍵角色。本課題以PI3K/Akt通路重要分子為誘餌，采用酵母雙雜交方法篩選人肝臟cDNA文庫，從蛋白質(zhì)一蛋白質(zhì)相互作用的角度，對肝

3、臟相關生長因子信號途徑的蛋白質(zhì)相互作用網(wǎng)絡進行初步研究。 本文成功構建了31個誘餌載體，包括PI3K/Akt通路的關鍵節(jié)點、激酶、負調(diào)控分子和代謝相關分子等，以其中28個符合篩選標準的誘餌進行了文庫篩選，獲得了488個候選陽性克隆，去除非編碼區(qū)序列和不符合讀框的序列后，得到了101個蛋白之間93對非冗余的相互作用。其中有8對已知相互作用，與已有報道相比，相互作用數(shù)據(jù)具有較高的覆蓋率；未報道相互作用中17對出現(xiàn)頻率在兩次及兩次以上

4、，有較高的可信度。隨后采用實驗驗證結合生物信息學分析的方法考察相互作用的可信度。實驗部分，采用酵母回轉(zhuǎn)驗證和免疫共沉淀實驗針對技術假陽性進行評價。隨機選取的用于回轉(zhuǎn)驗證的58對相互作用，陽性率為76％。從中選取15對相互作用進行免疫共沉淀實驗，陽性率為67％，與已報道的人類相互作用組中高可信度數(shù)據(jù)的共親和純化實驗的陽性比例(62％)相當。生物信息學方面，我們采用了多種方法對生物學假陽性進行了評價，包括PubMed和HPRD數(shù)據(jù)庫、轉(zhuǎn)錄組

5、和基因敲除表型、GO注釋、相互作用結構域、模式生物同源性和網(wǎng)絡拓撲結構等。發(fā)現(xiàn)除8對已知相互作用外，還有10對(11％)相互作用的誘餌和獵物基因名共同出現(xiàn)在PubMed文獻中，提示它們具有較高的功能相關性；34對(37％)相互作用的誘餌和獵物有相同亞細胞定位；15對(16％)相互作用的誘餌和獵物共享第3級及3級以上GO注釋；37對(40％)誘餌和獵物有相同或相似的網(wǎng)絡拓撲結構。為了從總體上描述相互作用的可信度，整合實驗數(shù)據(jù)和各種生物學相

6、關性分析的結果，采用簡單投票的方式，建立了一個含11個標準的可信度評分體系。高、中、低可信度相互作用分別占到21％、62％和17％。使用該評分體系，已知相互作用均為中高可信度相互作用、整體分布比例與Stelzl等人蛋白質(zhì)相互作用研究比例相當。 之后采用可視化軟件Osprey進行了網(wǎng)絡繪圖和數(shù)據(jù)的深入挖掘，從獲得的網(wǎng)絡可以看到，通過Y2H得到的相互作用對原有相互作用進行了有效補充和拓展，同時發(fā)現(xiàn)網(wǎng)絡中存在著一個與細胞應激相關的成簇

7、的模塊。以實驗數(shù)據(jù)、可信度評價結果及大量的文獻調(diào)研為依據(jù)，對得到的相互作用數(shù)據(jù)進行了深入的挖掘。發(fā)現(xiàn)了以Akt2-HRSPl2和TRB3-HRSP12的相互作用介導的肝再生和細胞應激之間潛在的交聯(lián)；通過GRB2-HNRPK和GRB2-SF384的相互作用揭示了GRB2在核內(nèi)的重要新功能：通過TRB3-SIAH1的相互作用揭示了TRB3的調(diào)控機制，為進一步的功能研究提供了重要線索。 最后選取了一對高可信度、可能通過泛素化途徑調(diào)控P

8、I3K/Akt通路的相互作用——泛素連接酶SIAH1和腳手架蛋白TRB3之間的相互作用進行了功能探討，初步實驗表明SIAH1參與并促進了TRB3的泛素化修飾和蛋白酶體途徑降解，過表達情況下SIAH1可以部分解除TRB3對Akt磷酸化的抑制作用，由此，SIAH1參與了對TRB3參與的信號通路如PI3K/Akt通路的調(diào)控。 綜上所述，本研究采用酵母雙雜交方法，從蛋白質(zhì)相互作用層面上對肝臟PI3K/Akt通路重要分子的相互作用網(wǎng)絡進行