蛇床子素通過PI3K-Akt通路抑制肝內(nèi)膽管癌的作用及機(jī)制研究.pdf

1、目的：
　　1.研究蛇床子素對(duì)ICC細(xì)胞系的抑制作用。
　　2.研究蛇床子素抑制ICC的分子機(jī)制。
　　3.研究蛇床子素在小鼠體內(nèi)對(duì)ICC移植瘤生長(zhǎng)的影響
　　實(shí)驗(yàn)方法：
　　一、使用 RBE及 HCCC-9810作為工具細(xì)胞系，在體外研究蛇床子素對(duì) ICC細(xì)胞系增殖及凋亡功能的影響。（1）通過CCK-8增殖實(shí)驗(yàn)研究蛇床子素對(duì)ICC細(xì)胞系增殖能力的抑制作用及其與濃度-時(shí)間的關(guān)系；通過克隆形成實(shí)驗(yàn)研究蛇床子素

2、在不同濃度及時(shí)間梯度下對(duì)ICC細(xì)胞系集落形成能力的影響。（2）通過Hoechst33342染色研究不同濃度的蛇床子素對(duì)ICC細(xì)胞系細(xì)胞形態(tài)的影響；通過流式細(xì)胞儀檢測(cè)不同濃度的蛇床子素對(duì)ICC細(xì)胞系凋亡功能的影響；
　　二、蛇床子素促進(jìn)ICC細(xì)胞系凋亡的機(jī)制研究。（1）通過羅丹明123染色后使用流式細(xì)胞儀檢測(cè)不同濃度的蛇床子素對(duì) ICC細(xì)胞線粒體膜電位的影響。（2）通過Western blot實(shí)驗(yàn)研究不同濃度蛇床子素對(duì)肝內(nèi)膽管癌細(xì)胞

3、系中凋亡相關(guān)蛋白如：cleaved caspase-3，caspase-3, cleaved caspase-9, caspase-9, cleaved PARP, Bcl-2, Bax的表達(dá)變化，并研究蛇床子素對(duì)于PI3K/Akt通路關(guān)鍵蛋白的影響，如：pi3k, Akt, p-Akt。（3）通過轉(zhuǎn)染 WT-Akt及 CA-Akt質(zhì)粒后使用 CCK-8細(xì)胞增殖實(shí)驗(yàn)研究Pi3k/Akt通路在蛇床子素抑制肝內(nèi)膽管癌增殖及促進(jìn)其凋亡過程中發(fā)

4、揮的作用。（4）通過流式細(xì)胞儀檢測(cè)凋亡水平研究轉(zhuǎn)染W(wǎng)T-Akt及CA-Akt質(zhì)粒對(duì)蛇床子素促凋亡能力的影響。（5）使用Western blot實(shí)驗(yàn)研究轉(zhuǎn)染W(wǎng)T-Akt及CA-Akt質(zhì)粒對(duì)Akt，p-Akt及細(xì)胞凋亡相關(guān)蛋白Bcl-2，Bax表達(dá)水平的影響；
　　三、蛇床子素在體內(nèi)抑制肝內(nèi)膽管癌的作用研究：（1）使用免疫缺陷裸鼠作為體內(nèi)研究對(duì)象，使用腹腔注射的方式給藥，通過觀察腫瘤的大小，研究不同濃度的蛇床子素對(duì)于肝內(nèi)膽管癌細(xì)胞系

5、HCCC-9810體內(nèi)移植瘤生長(zhǎng)能力的影響。（2）提取腫瘤蛋白，利用Western Blot實(shí)驗(yàn)研究蛇床子素在小鼠體內(nèi)對(duì)Akt、p-Akt及凋亡相關(guān)蛋白Bcl-2、Bax、cleaved PARP表達(dá)影響。
　　結(jié)果：
　　一、蛇床子素可以在體外抑制肝內(nèi)膽管癌細(xì)胞系的增殖能力并促進(jìn)其凋亡：（1）蛇床子素可以在體外抑制肝內(nèi)膽管癌細(xì)胞系的增殖能力：CCK-8細(xì)胞活性實(shí)驗(yàn)提示接受處理的ICC細(xì)胞的活性要小于對(duì)照組細(xì)胞，并且具有時(shí)間

6、-濃度梯度相關(guān)性；克隆形成實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明接受處理的 ICC細(xì)胞其克隆形成的數(shù)量以及單個(gè)克隆的大小都小于對(duì)照組細(xì)胞。（2）蛇床子素可以在體外促進(jìn)肝內(nèi)膽管癌的凋亡：Hoechst33342染色實(shí)驗(yàn)，經(jīng)過蛇床子素處理的細(xì)胞其細(xì)胞形態(tài)固縮碎裂，而對(duì)照組的細(xì)胞形態(tài)均一規(guī)則；流式細(xì)胞儀凋亡檢測(cè)表明接受蛇床子素處理的 ICC細(xì)胞其凋亡率明顯較對(duì)照組升高，并且具有濃度梯度相關(guān)性，以早期凋亡率的升高為主。
　　二、蛇床子素通過調(diào)控 PI3K通路激活肝

7、內(nèi)膽管癌細(xì)胞系的內(nèi)源性凋亡途徑：（1）；羅丹明123染色結(jié)果表明經(jīng)過蛇床子素處理的細(xì)胞其經(jīng)線粒體內(nèi)源性凋亡途徑的凋亡細(xì)胞數(shù)量較對(duì)照組明顯升高，并且呈濃度梯度相關(guān)性。（2）Western blot實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，隨著蛇床子素的濃度增加，線粒體凋亡途徑相關(guān)蛋白Bcl-2的表達(dá)水平逐漸下降，而促凋亡蛋白cleaved caspase-3，caspase-9和PARP的表達(dá)水平逐漸升高；Pi3k及p-Akt的表達(dá)水平隨著蛇床子素的濃度升高降低。（

8、3）轉(zhuǎn)染W(wǎng)T-Akt及CA-Akt質(zhì)粒后細(xì)胞活性實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，在相同濃度蛇床子素處理的情況下，轉(zhuǎn)染了WT-Akt及CA-Akt質(zhì)粒的細(xì)胞其細(xì)胞活性比未接受轉(zhuǎn)染的細(xì)胞活性要高；（4）轉(zhuǎn)染W(wǎng)T-Akt及CA-Akt質(zhì)粒后凋亡實(shí)驗(yàn)表明，在接受相同濃度蛇床子素處理的情況下，轉(zhuǎn)染了WT-Akt及CA-Akt質(zhì)粒的細(xì)胞其凋亡率較低。（5）轉(zhuǎn)染W(wǎng)T-Akt及CA-Akt質(zhì)粒后Western Blot實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，在接受相同濃度蛇床子素處理的情況下，轉(zhuǎn)

9、染了WT-Akt及CA-Akt質(zhì)粒的細(xì)胞其抗凋亡基因Bcl-2的表達(dá)水平較高，促凋亡基因Bax的表達(dá)水平較低。
　　三、蛇床子素可以在體內(nèi)抑制肝內(nèi)膽管癌：（1）體內(nèi)成瘤實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，在50mg/kg，100mg/kg，腹腔注射給藥，間斷給藥26天的條件下，接受蛇床子素處理的小鼠其體內(nèi)移植瘤的體積較小，并且給藥濃度的升高，移植瘤的體積逐漸降低；（2）移植瘤蛋白Western Blot實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，接受蛇床子素處理的小鼠，其移植瘤內(nèi)A

10、kt的表達(dá)沒有明顯變化，p-Akt的表達(dá)隨給藥濃度升高逐漸降低，抗凋亡蛋白 Bcl-2的表達(dá)水平隨給藥濃度的升高逐漸降低。促凋亡蛋白 Bax及 cleaved PARP的表達(dá)水平隨著給藥濃度的升高而升高。
　　結(jié)論：
　　1.蛇床子素可以體外抑制ICC細(xì)胞系HCCC-9810及RBE的增殖能力并且促進(jìn)其凋亡。
　　2.蛇床子素可以通過調(diào)控PI3K/Akt通路激活I(lǐng)CC細(xì)胞系內(nèi)源性凋亡途徑，從而促進(jìn)其凋亡過程。