SALL4抑制PTEN表達(dá)通過(guò)PI3K-AKT通路促進(jìn)膠質(zhì)瘤細(xì)胞增殖的研究.pdf

1、目的：近年來(lái)，隨著醫(yī)療事業(yè)飛速發(fā)展，膠質(zhì)瘤的早發(fā)現(xiàn)、早診斷已得到了有效保障；術(shù)中運(yùn)用顯微外科技術(shù)及神經(jīng)導(dǎo)航儀，一定條件下大大提高了膠質(zhì)瘤的手術(shù)切除率；此外，術(shù)后個(gè)體化的放化療、免疫治療等綜合治療手段也已到達(dá)廣泛使用。然而，即使膠質(zhì)瘤診療水平不斷的提高，膠質(zhì)瘤患者預(yù)后的改善、生存質(zhì)量的提高極為有限，作為目前顱內(nèi)最常見(jiàn)的惡性腫瘤的平均生存期僅為15-18個(gè)月。
　　導(dǎo)致腫瘤發(fā)生，并且迅速生長(zhǎng)的原因有很多，包括基因突變，藥物致癌，物理致

2、癌，化學(xué)致癌，遺傳等因素。在這其中癌基因的激活和抑癌基因的失活已得到研究界普遍認(rèn)可。近期研究發(fā)現(xiàn)人類婆羅雙樹樣基因4（SALL4）具有調(diào)控腫瘤的功能，并成為評(píng)估腫瘤預(yù)后的一個(gè)新標(biāo)記物。SALL4與參與果蠅多種器官發(fā)育的果蠅婆羅雙樹基因Spalt為同源基因，是近期新發(fā)現(xiàn)的原癌基因，編碼一種鋅指蛋白轉(zhuǎn)錄因子，位于人類20號(hào)染色體q13，分為SALL4A和SALL4B兩亞型。研究表明干性基因SALL4具有維持胚胎干細(xì)胞的多能性和自我更新的功能

3、，與許多腫瘤的發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)，包括白血病，肝癌，胃癌，食管癌，肺癌等常見(jiàn)惡性腫瘤。敲除SALL4基因能夠抑制某些腫瘤細(xì)胞的增殖，增加其凋亡，降低其侵襲能力，在肝細(xì)胞肝癌中高表達(dá)SALL4基因往往意味著更短的生存期和較差的預(yù)后。而抑癌基因PTEN的缺失或者突變亦參與多種惡性腫瘤的發(fā)生和發(fā)展，在某些腫瘤中SALL4可以靶向抑制PTEN的表達(dá)，發(fā)揮促癌作用。SALL4與膠質(zhì)瘤的關(guān)系尚不清楚。因此，我們首先檢測(cè)SALL4在膠質(zhì)瘤中的表達(dá)，再運(yùn)

4、用siRNA,下調(diào)膠質(zhì)瘤細(xì)胞株中SALL4表達(dá)，PTEN阻滯劑phen(bpv)處理低表達(dá)SALL4的細(xì)胞，研究SALL4對(duì)膠質(zhì)瘤生物學(xué)功能的影響及其作用機(jī)制。
　　方法：我們收集蘇州大學(xué)附屬第一醫(yī)院神經(jīng)外科近3年來(lái)，手術(shù)切除的不同級(jí)別的膠質(zhì)瘤標(biāo)本69例，標(biāo)本液氮中冷凍保存并提取其總得RNA，運(yùn)用實(shí)時(shí)定量PCR技術(shù)，檢測(cè)腫瘤標(biāo)本中SALL4的表達(dá)水平以及不同級(jí)別中SALL4表達(dá)有無(wú)差異。體外實(shí)驗(yàn)，我們分析不同級(jí)別膠質(zhì)瘤細(xì)胞株中SA

5、LL4表達(dá)水平，并選擇合適的膠質(zhì)瘤細(xì)胞株作為實(shí)驗(yàn)對(duì)象。運(yùn)用將siRNA-SALL4轉(zhuǎn)染技術(shù)，下調(diào)膠質(zhì)瘤細(xì)胞株U87和U251中SALL4基因的表達(dá)，與此同時(shí)使用PTEN抑制劑，進(jìn)而對(duì)腫瘤細(xì)胞增殖能力進(jìn)行檢測(cè)，予以細(xì)胞周期分析等。Wstern Blot分析 PTEN/PI3K/AKT信號(hào)通路相關(guān)蛋白,如PTEN,PI3K,P-PI3K,AKT,P-AKT,cyclin D1的表達(dá)變化。
　　結(jié)果：
　　1.SALL4在人腦膠質(zhì)

6、瘤及膠質(zhì)瘤細(xì)胞株中表達(dá)。運(yùn)用實(shí)時(shí)定量PCR技術(shù)，對(duì)6例非瘤腦組織及69例不同級(jí)別的人腦膠質(zhì)瘤標(biāo)本中SALL4表達(dá)進(jìn)行分析。其結(jié)果提示：在膠質(zhì)瘤標(biāo)本中SALL4水平比非瘤腦組織高（P<0.05），且隨著腫瘤級(jí)別增高SALL4表達(dá)水平亦明顯增高。不同種級(jí)別膠質(zhì)瘤細(xì)胞株中SALL4表達(dá)不同，與腫瘤標(biāo)本類似，級(jí)別越高的膠質(zhì)瘤細(xì)胞株SALL4表達(dá)水平越高（P<0.05）。
　　2.敲除SALL4基因，抑癌基因PTEN的表達(dá)明顯提高。SALL

7、4-siRNA轉(zhuǎn)染腫瘤細(xì)胞后，下調(diào)了SALL4的表達(dá)，分別從蛋白水平及mRNA水平檢測(cè)抑癌基因PTEN的表達(dá)，結(jié)果提示：下調(diào)SALL4，PTEN蛋白及mRNA明顯增加（P<0.05）。
　　3.下調(diào)SALL4的表達(dá)，U87及U251細(xì)胞增殖明顯受抑制。膠質(zhì)瘤細(xì)胞轉(zhuǎn)染SALL4-siRNA后，增殖能力下降，進(jìn)一步行細(xì)胞周期分析，結(jié)果提示細(xì)胞阻滯在G1，即處于靜止G1期細(xì)胞比例增加，而處于分裂S期細(xì)胞所占比例降低，而PTEN抑制劑能夠

8、很大程度上逆轉(zhuǎn)這種抑制效應(yīng)。
　　4. Western Blot技術(shù)分析敲除SALL4后，PTEN,PI3K/AKT通路相關(guān)蛋白改變。敲除SALL4后，PTEN表達(dá)上調(diào)，PI3K/AKT磷酸化水平下降，p-PI3K,p-AKT表達(dá)
　　水平受抑制，細(xì)胞周期素cyclinD1表達(dá)下降。預(yù)先用SALL4-siRNA處理膠質(zhì)瘤細(xì)胞株，再用PTEN抑制劑處理細(xì)胞，PI3K/AKT磷酸化水平的抑制效應(yīng)明顯改變。
　　結(jié)論:SAL