PTEN通過負(fù)調(diào)節(jié)PI3K-AKT信號通路下調(diào)內(nèi)皮素受體B抑制內(nèi)皮素-1引起的肝星狀細(xì)胞活化.pdf

1、目的：肝纖維化是繼發(fā)于各種慢性肝臟疾病之后反復(fù)的創(chuàng)傷愈合與瘢痕修復(fù)過程，其主要病理生理學(xué)特征是細(xì)胞外基質(zhì)(Extrcellular matrix，ECM)的生成與降解失衡，引起ECM的大量沉積，最終導(dǎo)致肝纖維化。為了進(jìn)一步探討ET-1及PTEN在HSCs激活方面的作用，本實驗通過研究過表達(dá)PTEN的HSC-T6在外源性ET-1的刺激下所產(chǎn)生的效應(yīng)，并應(yīng)用PI3K/AKT信號通路的特異性抑制劑LY294002模擬PTEN對PI3K/AKT

2、信號通路的阻斷作用，探討PTEN是否能夠通過負(fù)調(diào)節(jié)PI3K/AKT信號通路下調(diào)ETBR的表達(dá)從而抑制ET-1引起的HSCs的激活。
　　方法：①、實驗分組
　　本實驗按以下分組方式進(jìn)行:1、P組，PTEN轉(zhuǎn)染HSC-T6+ET-1組;2、 V組，空載PTEN的vector轉(zhuǎn)染HSC-T6+ET-1組;3、PB S+ET-1空白對照組;4、L+V組，空載PTEN的vector轉(zhuǎn)染HSC-T6+ET-1+LY294002組;5、

3、PB S+ET-1+LY294002組。
　?、?、細(xì)胞培養(yǎng)
　　大鼠肝星狀細(xì)胞系HSC-T6購自廣東科學(xué)院，細(xì)胞培養(yǎng)在含10％胎牛血清、100 IU/m青霉素、和100 mg/mL鏈霉素的DMEM培養(yǎng)基中，并在37℃含5％CO2的培養(yǎng)箱中孵育。
　?、邸⒓?xì)胞瞬時轉(zhuǎn)染
　　在轉(zhuǎn)染前24小時，指數(shù)級生長的HSC-T6以每孔2×105的濃度接種于6孔板，待細(xì)胞鋪滿70％-80％的培養(yǎng)孔時開始轉(zhuǎn)染。PTEN及空載PTEN

4、的vector采用lipofectamine2000，根據(jù)試劑盒說明，以最終100nM的濃度轉(zhuǎn)染進(jìn)入HSC-T6，并設(shè)置PBS為空白對照組。轉(zhuǎn)染穩(wěn)定后各組加入10-7mol/L ET-1，12h在L+V組及L+PBS組加入50uM/L LY294002，ET-1作用48h后檢測各指標(biāo)的蛋白質(zhì)及基因水平的表達(dá)。
　?、堋⒌鞍踪|(zhì)免疫印跡法(western blot)
　　α-SMA,ETBR及ETAR的蛋白表達(dá)水平采用weste

5、rn blot方法檢測。經(jīng)ET-1作用48h后，收集細(xì)胞樣品，加入相應(yīng)體積的含有1％ Nonidet P-40，0.5％sodium deoxycholate，0.1％sodium dodecyl sulfate和蛋白酶抑制劑的RIPA蛋白裂解液，冰上放置30 min，然后4℃，12000 r/min離心10 min，吸出上清，得到總蛋白樣品。樣品蛋白質(zhì)采用BCA蛋白定量試劑盒定量。調(diào)整樣品蛋白質(zhì)濃度使其接近，保證每個樣品孔蛋白質(zhì)上樣量

6、一致.蛋白質(zhì)經(jīng)10％ SDS-PAGE電泳后轉(zhuǎn)移至PVDF膜上(MILLIPORE)。PVDF膜以5％脫脂奶粉封閉1h后，加入一抗4℃過夜。在此過程中所用到的抗體α-SMA(1;1000 dilution，Santa CruzInc), ETBR(1∶1500 dilution; Santa Cruz Inc.), ETAR(1;1500 dilution; Santa CruzInc), Glyceraldehyde-3-phosph

7、ate dehydrogenase(GAPDH)(1∶1000 dilution;Shanghai Sangon Biotech)。取出PVDF膜，經(jīng)洗滌后，再加入HRP標(biāo)記的二抗(1∶4000 dilution，F(xiàn)ude Biotech)，室溫下孵育1h。每步反應(yīng)結(jié)束均用PBST洗滌3次，每次10 min。最后用ECL化學(xué)發(fā)光3-5min，使用Odyssey成像系統(tǒng)掃膜。結(jié)果以目的蛋白與GAPDH吸光度的比值表示。
　　⑤、實時

8、熒光定量PCR(qRT-PCR)
　　ET-1作用后48h，采用Trizol（Invitrogen）試劑盒，按說明提取細(xì)胞總RNA。將RNA提取物1ug，逆轉(zhuǎn)錄為cDNA，并置于-80℃保存?zhèn)溆谩＝?0ul的PCR反應(yīng)體系包括:cDNA，上下游引物、2x SYBR Green qPCR SuperMix、以及dH2O。采用LightCycler480IISystem進(jìn)行PCR擴(kuò)增，建立最適的PCR反應(yīng)體系，擴(kuò)增相應(yīng)的產(chǎn)物。β-a

9、ctin被用作內(nèi)參。ETAR引物序列:上游5'-TCTGATGACCTCGGTCCC-3'，下游5'-GTTCATGC TGTCCTTATGGCT-3'，ETBR引物序列:上游5'-AATTACGAT GGA CTAC AAA GG AAG TT A-3'，下游5'-GCAAGCAGAAATAGAAACTGAATAGC-3'.β-actin引物序列:上游5'-TCACCCACACTGTGCCC ATCTACGA-3'，下游5'-CAGC

10、GGAACCGCTCATTGCCAATGG-3'。
　　所有數(shù)據(jù)以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差((x)±s)表示。采用SPSS21.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計分析。組間均數(shù)差異性比較采用單因素方差分析(One-way ANOVA)。P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。
　　結(jié)果：1、ET-1作用后各組各指標(biāo)的變化
　　①、ET-1作用后各組α-SMA的表達(dá)變化
　　Western blot檢測結(jié)果顯示，10-7mol/L外源性ET-1作用于各組

11、HSC-T6后，P組α-SMA的相對表達(dá)量為(0.35±0.01)，明顯低于V組（0.46±0.01）及PBS組（0.46±0.01）(p＜0.05)，差異有統(tǒng)計學(xué)意義。
　?、?、ET-1作用后各組ETBR的表達(dá)變化
　　Western blot檢測結(jié)果顯示，10-7mol/L外源性ET-1作用于各組HSC-T6后，ETBR蛋白的相對表達(dá)量在P組為(0.42±0.01)顯著低于V組（0.85±0.01）及PBS組(0.83±

12、0.01)，(p＜0.05)，差異有統(tǒng)計學(xué)意義。qRT-PCR結(jié)果顯示，10-7mol/L外源性ET-1作用于各組細(xì)胞后，ETBR mRNA的相對表達(dá)量在P組為(0.63±0.06)顯著低于對照組（V組:1.61±0.13，PBS組:1.50±0.03）(p＜0.05)，差異有統(tǒng)計學(xué)意義。
　?、?、ET-1作用后各組ETAR的表達(dá)變化
　　Western blot檢測結(jié)果顯示，10-7mol/L外源性ET-1作用于各組HSC

13、-T6后，ETAR蛋白的相對表達(dá)量在P組為(0.22±0.01)與V組(0.22±0.01)及PBS組(0.22±0.01)無明顯差異。qRT-PCR結(jié)果顯示，10-7mol/L外源性ET-1作用于各組細(xì)胞后，ETAR mRNA的相對表達(dá)量在P組為(0.46±0.01)，V組(0.46±0.01)，PBS組(0.46±0.01)，(p＞0.05)，各組之間差異無統(tǒng)計學(xué)意義。
　　2、LY294002作用后各組各指標(biāo)的變化
　

14、?、佟Y294002作用后各組α-SMA的表達(dá)變化
　　Western blot檢測結(jié)果顯示，LY294002作用于各組HSC-T6后，α-SMA的相對表達(dá)量在L+V組及L+PBS組為(0.34±0.01，0.34±0.01)，顯著低于V組及PBS組α-SMA的表達(dá)(p＜0.05)，但與P組α-SMA的表達(dá)無顯著差異(p＞0.05)。
　?、凇Y294002作用后各組ETBR的表達(dá)變化
　　Western blot

15、檢測結(jié)果顯示，LY294002作用于各組HSC-T6后，ETBR蛋白的相對表達(dá)量在L+V組及L+PBS組為(0.43±0.01，0.44±0.01)，顯著低于V組及PBS組(p＜0.05)，但與P組ETBR蛋白的相對表達(dá)無顯著差異(p＞0.05)。qRT-PCR結(jié)果顯示，ETBR mRNA的相對表達(dá)量在L+V組及L+PBS組為(0.65±0.02，0.64±0.01)，顯著低于V組ETBR mRNA的表達(dá)(p＜0.05)，但與P組ETB

16、R的表達(dá)無顯著差異(p＞0.05)。
　　③、LY294002作用后各組ETBR的表達(dá)變化
　　Western blot檢測結(jié)果顯示，LY294002作用于各組HSC-T6后，ETAR蛋白的相對表達(dá)量在L+V組及L+PBS組為(0.22±0.02，0.23±0.01)，與P組、V組及PBS組ETAR蛋白的相對表達(dá)量無明顯差異(p＞0.05)。qRT-PCR結(jié)果顯示， ETAR mRNA的相對表達(dá)量在L+V組及L+PBS組為(